OSN-SAbstraktOSN-E

Fotometrick√° reakce je nejrozŇ°√≠ŇôenńõjŇ°√≠m zpŇĮsobem anal√Ĺzy v klinick√© chemii, fotometrick√© detektory patŇô√≠ do z√°kladn√≠ v√Ĺbavy mnoha speci√°ln√≠ch analytick√Ĺch technik. Pro rutinn√≠ mńõŇôen√≠ se pouŇĺ√≠vaj√≠ fotometry filtrov√©, hodnocen√≠ absorpńćn√≠ch spekter v urńćit√Ĺch rozsaz√≠ch vlnov√Ĺch d√©lek umoŇĺŇąuj√≠ spektrofotometry.

 

 

OSN-SSouvisející informaceOSN-E

Spektroskopie

 

OSN-STextOSN-E

 

Text je ńćlenńõn podle osnovy:

A.      Princip absorpńćn√≠ elektronov√© spektroskopie

B.      Lambert-BeerŇĮv z√°kon

C.      Absorpńćn√≠ spektra

D.      Fotometry, spektrofotometry

 

 

A. Princip absorpńćn√≠ elektronov√© spektroskopie

 

a)       Absorbovan√° energie

Chemick√© l√°tky se liŇ°√≠ strukturou molekuly, tedy uspoŇô√°d√°n√≠m elektronŇĮ a atomov√Ĺch jader. Chemick√° l√°tka je stabiln√≠ pŇôi uspoŇô√°d√°n√≠ s nejniŇĺŇ°√≠ energi√≠. Dod√°n√≠m energie (z√°Ňôen√≠m, n√°razem elektronu, prudk√Ĺm zv√ĹŇ°en√≠m teploty apod.) pŇôejde molekula ze z√°kladn√≠ho do tzv. excitovan√©ho stavu, tedy na vyŇ°Ň°√≠ energetickou hladinu. Vzd√°lenosti energetick√Ĺch hladin odpov√≠daj√≠ urńćit√©mu energetick√©mu stavu (stavy valenńćn√≠ch elektronŇĮ, vibrańćn√≠, rotańćn√≠ stavy). Elektronov√Ĺm pŇôechodŇĮm, kter√© vyŇĺaduj√≠ energii 300 - 1200 kJ/mol odpov√≠d√° ultrafialov√© z√°Ňôen√≠, vibrańćn√≠ pŇôechody vyŇĺaduj√≠ des√≠tky kJ/mol, coŇĺ odpov√≠d√° infrańćerven√©mu z√°Ňôen√≠, rotańćn√≠ pŇôechody spotŇôebuj√≠ desetiny kJ/mol (mikrovlnn√° oblast z√°Ňôen√≠).

 

b)      Absorpńćn√≠ elektronov√° spektra

Podm√≠nkou, aby sledovan√° l√°tka absorbovala v ultrafialov√© nebo viditeln√© oblasti z√°Ňôen√≠, je pŇô√≠tomnost vazebn√Ĺch p elektronŇĮ ve vazebn√Ĺch molekulov√Ĺch orbitalech a nep√°rov√Ĺch elektronŇĮ v nevazebn√Ĺch molekulov√Ĺch orbitalech. ŇĹivotnost excitovan√© molekuly je velmi kr√°tk√° (10-8 s), pohlcen√° energie se ńćasto zmńõn√≠ v tepelnou, kter√° se absorbuje pŇô√≠tomn√Ĺm rozpouŇ°tńõdlem - nez√°Ňôiv√Ĺ pŇôechod do z√°kladn√≠ho stavu. Pokud molekula odevzd√° z√≠skanou energii vyz√°Ňôen√≠m fotonu, vznik√° rozpt√Ĺlen√© z√°Ňôen√≠. Chromofory jsou atomy, nebo skupiny atomŇĮ silnńõ absorbuj√≠c√≠ v UV oblasti, zpravidla obsahuj√≠ n√°sobn√© (hlavnńõ dvojn√©) vazby.

 

c)       Barevnost l√°tek

Absorpce l√°tek v oblasti viditeln√©ho z√°Ňôen√≠, tj. v rozsahu vlnov√Ĺch d√©lek 400 - 750 nm, vede k barevnosti l√°tek. PrŇĮhledn√° l√°tka m√° barvu odpov√≠daj√≠c√≠ z√°Ňôen√≠, kter√© sama neabsorbuje, barevn√Ĺ roztok absorbuje z√°Ňôen√≠ doplŇąkov√© barvy (roztok, kter√Ĺ se okem jev√≠ jako ńćerven√Ĺ, absorbuje z viditeln√©ho svńõtla pŇôedevŇ°√≠m barvu modrozelenou, neabsorbuje barvu ńćervenou).

 

 

 

 

B. Lambert-BeerŇĮv z√°kon

Proch√°z√≠-li svńõteln√Ĺ paprsek prostŇôed√≠m, kter√© je schopno absorbovat, je intenzita paprsku vstupuj√≠c√≠ho vyŇ°Ň°√≠ neŇĺ intenzita paprsku proŇ°l√©ho t√≠mto prostŇôed√≠m. Tento jev byl v roce 1729 poprv√© formulov√°n P. Bouguerem a pozdńõji jeŇ°tńõ jednou objeven Lambertem.

 

Lze jej vyj√°dŇôit rovnic√≠:¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬† I = I0 * e-bd

 

 

kde:

I0 - intenzita vstupujícího paprsku

I - intenzita paprsku po prŇĮchodu absorbuj√≠c√≠m prostŇôed√≠m

d - vzd√°lenost od m√≠sta, kde paprsek vstupuje do absorbuj√≠c√≠ho prostŇôed√≠

b - absorpńćn√≠ (napierovsk√Ĺ) koeficient

 

PŇôeveden√≠m vztahu na dekadick√© logaritmy:

 

            log I/ I0 = log T = -a * d

 

kde:

T - transmitance (propustnost)

a - absorpńćn√≠ koeficient (line√°rn√≠)

 

V r. 1852 uk√°zal Beer, Ňĺe u mnoha roztokŇĮ vznikl√Ĺch rozpuŇ°tńõn√≠m l√°tek, jeŇĺ absorbuj√≠ svńõtlo, je koeficient a pŇô√≠mo √ļmńõrn√Ĺ koncentraci c rozpuŇ°tńõn√© l√°tky. Spojen√≠m Lambertova vztahu a Beerov√Ĺch poznatkŇĮ je pops√°n z√°kladn√≠ vztah pro spektrofotometrick√© metody chemick√© anal√Ĺzy, Lambert-BeerŇĮv z√°kon platn√Ĺ pro monochromatick√© svńõtlo:

 

¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬†¬† A = 嬆 * c * d = -log T = log I0/I

 

kde:

A - absorbance

c - koncentrace rozpuŇ°tńõn√© l√°tky

d - tlouŇ°Ň•ka absorbuj√≠c√≠ vrstvy

嬆 - mol√°rn√≠ absorpńćn√≠ koeficient

 

 

Charakteristika ultrafialov√Ĺch (UV), viditeln√Ĺch (VIS) a bl√≠zk√Ĺch infrańćerven√Ĺch (IńĆ) spekter

 

Lambda (nm)

oblast

barva absorbovan√©ho svńõtla

<380

ultrafialov√°

neviditeln√°

380 ‚Äď 440

viditeln√°

fialov√°

440 ‚Äď 500

viditeln√°

modr√°

500 ‚Äď 580

viditeln√°

zelen√°

580 ‚Äď 600

viditeln√°

Ňĺlut√°

600 ‚Äď 620

viditeln√°

oranŇĺov√°

620 ‚Äď 750

viditeln√°

ńćerven√°

750 ‚Äď 2000

bl√≠zk√° IńĆ

neviditelná UV - blízká

220 - 380 nm

dalek√°

< 220 nm

 

 

Spektrofotometrick√° nomenklatura

 

N√°zev

Symbol

Definice

Absorbance

A

-log T = log I0/I

Absorpńćn√≠ koeficient

a

A/d * c (c v g/l)

(absorptivita)

Mol√°rn√≠ absorpńćn√≠ koeficient

ε

A/d * c (c v mol/l)

(molární absorptivita)

Délka dráhy paprsku

d

tlouŇ°Ň•ka vrstvy (kyvety)

Transmitance

T

I / I0

Jednotka vlnové délky

nm

10-9 m

Absorpńćn√≠ maximum

λmax

vlnov√° d√©lka pŇôi maxim√°ln√≠ absorpci svńõtla

 

 

C. Absorpńćn√≠ spektra

Na absorpńćn√≠ch kŇôivk√°ch se vyhodnocuje pŇô√≠tomnost maxim, jejich intenzita, pońćet minim, inflexn√≠ch a izobestick√Ĺch bodŇĮ.

 

Zmńõny v absorpńćn√≠ch spektrech

Vlivem chemick√Ĺch zmńõn napŇô. zaveden√≠m dalŇ°√≠ charakteristick√© skupiny do molekuly nebo zmńõnou pouŇĺit√©ho rozpouŇ°tńõdla nast√°v√° posun absorpńćn√≠ho maxima:

 

-          posun se zmńõnou vlnov√© d√©lky absorpńćn√≠ho maxima

  1. batochromn√≠ posun - vodorovnńõ s osou vlnov√Ĺch d√©lek smńõrem k vyŇ°Ň°√≠ vlnov√© d√©lce maxima
  2. hypsochromn√≠ - pŇôi sniŇĺov√°n√≠ vlnov√© d√©lky maxima

 

 

 

-          posun se zmńõnou intenzity absorpńćn√≠ho maxima (tj. zmńõnou mol√°rn√≠ho absorpńćn√≠ho koeficientu)

  1. hyperchromn√≠ posun je prov√°zen zv√ĹŇ°en√≠m intenzity maxima absorpńćn√≠ho p√°su
  2. hypochromní posunutí je provázeno poklesem absorpce

 

 

Izobestick√Ĺ bod

Izobestick√Ĺ bod odpov√≠d√° jedn√© vlnov√© d√©lce na absorpńćn√≠ch kŇôivk√°ch acidobazick√Ĺch indik√°torŇĮ pŇôedstavuje vz√°jemn√Ĺ pŇôechod mezi protonovou a neprotonovou formou v z√°vislosti na pH, v tomto bodńõ je mol√°rn√≠ absorpńćn√≠ koeficient pro obńõ formy stejn√Ĺ.

 

 

D. Fotometry, spektrofotometry

 

Typy fotometrŇĮ a jejich z√°kladn√≠ komponenty

 

jednopaprskové:

-          zdroj svńõtla

-          vstupn√≠ Ň°tńõrbina

-          monochrom√°tor

-          v√Ĺstupn√≠ Ň°tńõrbina

-          kyveta

-          detektor

 

dvoupaprskové:

-          zdroj svńõtla

-          zrcadlem rozdńõlen√≠ paprsku na dva rovnobńõŇĺn√©

-          dvńõ vstupn√≠ Ň°tńõrbiny

-          dva monochrom√°tory

-          dvńõ v√Ĺstupn√≠ Ň°tńõrbiny

-          dvńõ paraleln√≠ kyvety (vzorkov√° + srovn√°vac√≠)

-          dva detektory zdroj svńõtla

-          vstupn√≠ Ň°tńõrbina

-          monochrom√°tor

-          v√Ĺstupn√≠ Ň°tńõrbina

-          hranolem a soustavou zrcadel vymezen√≠ dvou rovnobńõŇĺn√Ĺch paprskŇĮ

-          dvńõ paraleln√≠ kyvety (vzorkov√° + srovn√°vac√≠)

-          oba paprsky soustŇôedńõny soustavou zrcadel do jednoho m√≠sta, kde se intenzity vz√°jemnńõ odeńćtou

-          detekce v√Ĺsledn√©ho sign√°lu jedn√≠m detektorem

 

 

Zdroje svńõtla:

-          v√Ĺbojky (vod√≠kov√°, deuteriov√°, xenonov√°) - pro bl√≠zkou ultrafialovou (UV) oblast,

-          Ňĺ√°rovky - Ňĺhaven√° wolframov√° spir√°la - pro viditelnou (VIS) a infrańćervenou (IńĆ) oblast,

-          spektr√°ln√≠ lampy (monochromatick√© z√°Ňôen√≠) - rtuŇ•ov√° v√Ĺbojka, kŇôemenn√© halogenov√© lampy.

 

Monochrom√°tor:

-          vstupn√≠ Ň°tńõrbina

-          disperzn√≠ prvek

-          zaostŇôovac√≠ soustava

-          v√Ĺstupn√≠ Ň°tńõrbina

 

Monochromatick√© z√°Ňôen√≠ je elektromagnetick√© z√°Ňôen√≠ velmi √ļzk√©ho oboru kmitońćtŇĮ (vlnov√Ĺch d√©lek). Monochrom√°tory jsou optick√° zaŇô√≠zen√≠ jimiŇĺ se ze spektra mechanicky vymez√≠ jeho urńćit√° ńć√°st. Disperzn√≠m prvkem v monochrom√°toru je hranol nebo mŇô√≠Ňĺka. Vymezen√≠ √ļzk√©ho p√°su monochromatick√©ho z√°Ňôen√≠ je d√°no v√Ĺstupn√≠ Ň°tńõrbinou, poŇĺadovan√° vlnov√° d√©lka se nastavuje pŇô√≠m√Ĺm ot√°ńćen√≠m disperzn√≠ho prvku. NejvyŇ°Ň°√≠ kvalita monochromatick√©ho z√°Ňôen√≠ se definuje jako "efektivn√≠ spektr√°ln√≠ Ň°√≠Ňôka p√°su".

 

MoŇĺnost plynul√© zmńõny vymezen√≠ monochromatick√©ho z√°Ňôen√≠ je vyuŇĺ√≠v√°na pro sn√≠m√°n√≠ spekter, pŇô√≠stroje tohoto typu jsou naz√Ĺv√°ny spektrofotometry.

 

Filtry:

Vymezuj√≠ ze spojit√©ho z√°Ňôen√≠ nejuŇĺŇ°√≠ p√°s monochromatick√©ho z√°Ňôen√≠:

-          barevn√© - vrstvińćka oxidu kovu na sklenńõn√© podloŇĺce nebo Ňĺelatinov√° vrstva vybarven√° organick√Ĺm barvivem,

-          interferenńćn√≠ - vyuŇĺ√≠vaj√≠ mnohon√°sobnou interferenci z√°Ňôen√≠ mezi mezn√≠mi plochami s dobr√Ĺmi odrazov√Ĺmi vlastnostmi.

 

Charakteristiku filtru d√°v√° jeho kŇôivka propustnosti, poloŇ°√≠Ňôka odpov√≠d√° intervalu vlnov√Ĺch d√©lek pŇôi polovińćn√≠ propustnosti filtru. ńĆ√≠m je rozsah poloŇ°√≠Ňôky filtru uŇĺŇ°√≠, t√≠m je filtr lepŇ°√≠. PŇô√≠stroje s vymńõniteln√Ĺmi filtry jsou urńćeny pro mńõŇôen√≠ pŇôi vybran√Ĺch oblastech vlnov√Ĺch d√©lek, slouŇĺ√≠ pro rutinn√≠ mńõŇôen√≠, jsou naz√Ĺv√°ny fotometry.

 

Kyvety:

Pro fotometrick√° mńõŇôen√≠ se pouŇĺ√≠vaj√≠ kyvety sklenńõn√© a plastov√© (pro viditelnou oblast spektra) nebo kŇôemenn√© pro mńõŇôen√≠ v ultrafialov√© oblasti. TlouŇ°Ň•ka kyvety b√Ĺv√° obvykle 1 cm (pŇôi manu√°ln√≠m mńõŇôen√≠, analyz√°tory s fotometrickou detekc√≠ pouŇĺ√≠vaj√≠ kyvety menŇ°√≠ch rozmńõrŇĮ), bńõŇĺn√© je i pouŇĺ√≠v√°n√≠ prŇĮtokov√Ĺch kyvet a prŇĮtokov√Ĺch cel.

 

Detekce:

Fotometrick√° detekce je zaloŇĺena nejńćastńõji na fotoelektrick√©m efektu, kdy energie z√°Ňôen√≠ se pŇôemńõŇąuje na mńõŇôitelnou elektrickou energii:

a)       hradlov√Ĺ ńćl√°nek,

b)       foton√°sobińć,

c)       fotodiodov√© pole.

 

PoŇĺadavky na laboratorn√≠ fotometr:

-          minim√°ln√≠ mńõŇôen√© objemy,

-          end point reakce,

-          kinetick√© mńõŇôen√≠,

-          line√°rn√≠, neline√°rn√≠ kalibrace,

-          programovatelnost a uloŇĺen√≠ parametrŇĮ metod,

-          automatick√© podavańće pro s√©riov√© anal√Ĺzy,

-          automatick√© zpracov√°n√≠ dat,

-          komunikace s pońć√≠tańćovou s√≠t√≠.

 

OSN-SAutorské poznámkyOSN-E

Jaroslava V√°vrov√°