OSN-SAbstraktOSN-E

Základní princip plynové chromatografie spočívá v tom, že mobilní fáze je plynná a separované složky jsou rovněž ve stavu plynném. Stacionární fáze (pevná látka nebo kapalina) působí selektivně, na základě vzájemných interakcí stacionární fáze-vzorek dochází k rozdělení a detekci analyzovaných komponent.

OSN-SSouvisející informaceOSN-E

Chromatografie

KEY-SchromatografieKEY-E, KEY-Splynová chromatografieKEY-E, KEY-Sstacionární fázeKEY-E, KEY-Smobilní fázeKEY-E, KEY-Spneumatické obvodyKEY-E, KEY-Sdávkovací zařízeníKEY-E, KEY-Snáplňové kolonyKEY-E, KEY-Skapilární kolonyKEY-E, KEY-SdetektorKEY-E

OSN-STextOSN-E

Text je členěn dle osnovy:

A. Pneumatické obvody

A.- 1. Zdroje nosného plynu a pomocných plynů

A.- 2. Čištění plynů

A.- 3. Regulace a měření tlaku a průtoku nosného plynu

B. Dávkovací zařízení

C. Kolony

C.- 1. Náplňové kolony

C.- 2. Kapilární kolony

D. Detekční systém

D.- 1. Tepelně vodivostní detektor (TCD)

D.- 2. Plamenový ionizační detektor (FID)

D.- 3. Termoionizační selektivní detektor (TSD,AFID, NPD)

D.- 4. Fotoionizační detektor (PID)

D.- 5. Heliový detektor (HeD)

D.- 6. Detektor elektronového záchytu (ECD)

D.- 7. Hmotnostní detekce (GC-MS)

E. Termostaty

F. Zpracování signálu detektoru a ostatních informací

G. Příprava vzorků

Plynová chromatografie - úvod

Mají-li být hodnoty naměřené metodou plynové chromatografie objektivně reprodukovatelné a správné, musí platit definované tlakové, tokové a teplotní parametry celého přístroje. Přístroj pro plynovou chromatografii je z tohoto hlediska systémem několika obvodů:

- Pneumatické obvody (zdroje nosného plynu a pomocných plynů, zařízení pro čištění, regulaci, měření tlaku a průtoku plynů)

- Dávkovací zařízení

- Kolony

- Detekční systém

- Termostaty

- Zpracování signálu detektoru a ostatních informací

1) zdroj nosného plynu

2) čištění plynu

3) regulace

4) dávkovací zařízení

5) detektor

6) termostat

7) separační kolona

8) zesilovač signálu

9) výstup dat

A. Pneumatické obvody

A.- 1. Zdroje nosného plynu a pomocných plynů.

Jako nosný plyn může být použit každý plyn o vhodných vlastnostech, musí být dostatečně čistý, vhodný pro použitý detektor, inertní vůči stacionární fázi, analyzovaným látkám a materiálu těch částí chromatografu, se kterými přijde do styku. Pomocné plyny umožňují funkci detektorů, dávkování, chlazení. Běžně používanými nosnými plyny jsou dusík, argon, helium, vodík, mezi pomocné plyny patří obvykle vzduch, kyslík, vodík, oxid uhličitý, oxid dusný. Zdrojem nosného i pomocného plynu jsou většinou ocelové tlakové lahve naplněné příslušným plynem. Jiným zdrojem plynů jsou i komerčně dodávané speciální elektrolyzéry pro vodík, kyslík oxid uhličitý aj., popřípadě kompresory na vzduch.

A.- 2. Čištění plynů.

Při stopové analýze, při použití stacionárních fází citlivých na kyslík, vodu aj. a při práci s kolonou za vyšších teplot se musí nosný plyn čistit. Zbavuje se vodní páry, kyslíku, nižších uhlovodíků apod., a to fyzikálním i chemickým způsobem nebo kombinací obou. K sušení plynů se používají především molekulová síta, silikagel nebo aktivní uhlí. Kyslík a další nečistoty lze z nosného plynu odstranit reakcí se speciálními katalyzátory. Komerčně jsou dodávány trubice se vhodnou náplní, které se umístí v cestě mezi zdroj plynu a jeho vstup do separačního systému plynového chromatografu.

A.- 3. Regulace a měření tlaku a průtoku nosného plynu

Komerčně dodávané chromatografy bývají vybaveny regulátory tlaku a průtoku pro všechny používané plyny, v dokonalejším zapojení pak kombinací regulátoru průtoku se zpětným regulátorem tlaku. Používají se např. regulátory membránové nebo regulátory s vlnovcem. Tlaky v plynech se měří celokovovými manometry s odpovídajícím rozsahem a přesností. Pro regulaci tlaků, resp. průtoků, se snímají tlaky tenzometrickými čidly napojenými na mikroprocesor.

B. Dávkovací zařízení

Dávkovací zařízení se obvykle nachází ve vyměnitelném víku termostatu co nejblíže vstupu do kolony. Vzorek se vnáší buď do proudu nosného plynu nebo přímo do kolony. Volba dávkovacího procesu je určena jak typem použité kolony, tak vlastnostmi analyzovaných látek. Aby byla maximálně využita separační účinost kolony, je třeba dávkovat malá množství vzorku, která přichází na kolonu v plynném stavu v ostré zóně. Teplota nástřikového bloku se volí zpravidla asi o 50°C vyšší než je bod varu nejvýše vroucí složky analyzované směsi.

Dávkovací proces se skládá z několika kroků:

- odměření vzorku (mikrostříkačka, kalibrovaná kapilára, obtokové dávkovače, kapiláry),

- zavedení do nástřikové části chromatografu nebo až do kolony,

- rychlého odpaření vzorku nebo jeho rozptýlení do aerosolového stavu,

- transportu odpařeného vzorku z nástřikové části nosným plynem do kolony.

Dávkovací zařízení by mělo splňovat kriteria:

- rychlý převod kapalných a tuhých vzorků do plynného stavu,

- během převodu do plynného stavu by nemělo docházet ke změnám ve složení vzorku,

- dávkování by nemělo způsobovat tlakové rázy a porušovat rovnovážné poměry v koloně,

- klasický způsob dávkování do kapilárních kolon předpokládá, že množství a objem vzorku nepřesáhne kapacitu kolony.

Dávkování plynů:

- plynovými byretami,

- plynotěsnými injekčními stříkačkami,

- obtokovými dávkovacími kohouty.

Dávkování kapalin a tuhých látek: - mikrostříkačky

Vzorky s vysokou koncentrací analyzované látky, viskózní kapaliny a tuhé vzorky se dávkují v roztocích těkavých rozpouštědel.

Automatická dávkovací zařízení:

Při dávkování plynů se používá řada obtokových systémů, které mohou dávkovat zvolená množství v určitém časovém intervalu. V systému zařazené vícecestné kohouty jsou ovládány pneumaticky. Kapalné látky a roztoky jsou dávkovány jako takové nebo ve formě par odebíraných nad kapalinou automatickými dávkovači, které pracují na injekčním principu. Dávkovací zařízení umožňuje použít dávkování s děličem toku nebo bez něj, injektor s programovanou teplotou, dávkovat vzorek do kolony (on-column), dávkovat z předkolony nebo dávkovat z pyrolyzéru. Volba zařízení a způsobu dávkování závisí na typu vzorku, koncentraci stanovovaných látek, jejich těkavosti, bodu varu a tepelné i chemické stálosti.

C. Kolony

Kolona je považována za srdce chromatografu a na jejím výběru závisí úspěch analýzy. Používají se dva základní typy kolon - náplňové a kapilární. Do roku 1957 se používaly pouze náplňové kolony s různými typy sorbentů, po roce 1957 se začaly uplatňovat kolony kapilární, jejichž použití při současné instrumentaci převládá.

C.- 1. Náplňové kolony:

Náplňové kolony jsou skleněné nebo kovové trubice o vnitřním průměru 2 - 5 mm (nejčastěji 2 mm) naplněné buď adsorbentem (GSC) nebo nosičem smočeným zvolenou stacionární fází (GLC). Délky kolon o vnitřním průměru 2 mm se pohybují v rozmezí 0,9 - 3,5 m, preferují se kolony skleněné se silylovaným vnitřním povrchem. Vzhledem k omezenému prostoru termostatu, v němž je kolona umístěna, tvarují se náplňové kolony obvykle do spirály.

Adsorbenty pro GSC:

Adsorbenty se dělí na základě mezimolekulárních interakcí na nespecifické a specifické. Nespecifickým adsorbentem může být např. aktivní uhlí, specifickými jsou silikagel, alumina, molekulová síta aj.

Nosiče pro GSC:

Nejrozšířenějšími nosiči v plynové chromatografii jsou různě upravené křemeliny. Nevýhodou těchto nosičů je přítomnost aktivních center (silanolové a siloxanové skupiny), která způsobují nežádoucí chvostování polárnějších složek vzorku při separaci. Potlačení vlivu silanolových skupin se provádí silylací, které předchází kyselé praní nosiče.

C.- 2. Kapilární kolony

Převážná většina aplikací se provádí na křemenných kapilárních kolonách. Jako stacionární fáze se používají univerzálně často nepolární silikonové fáze (SE-30, OV-1, SE-52 apod.) nebo imobilizované fáze Carbowaxu.

Kolony s tenkou vrstvou stacionární fáze Kolony, kde stacionární fáze je fixována na vnitřní stěně jako tenká vrstvička adsorbentu nebo smočeného inertního nosiče, známé jsou pod označením:

- PLOT (Porous Layer Open Tubular),

- SCOT (Support Coated Open Tubular).

Kapilární kolony se silným filmem stacionární fáze - SCOT a PLOT kolony jsou nahrazovány kolonami s filmem stacionární fáze o tloušťce jednotek až desítek mikrometrů. Zvládnutá technika imobilizace stacionárních fází pomocí prostorového zesítění různých stacionárních fází zaručuje stálost tohoto typu kolon.

D. Detekční systém

Chromatografický detektor by měl být citlivý, stabilní, měl by zajišťovat maximální rychlost odezvy na změnu ve složení plynu opouštějícího chromatografickou kolonu. Mezi základní detektory se počítá tepelně vodivostní, plamenový ionizační, plamenový ionizační s alkalickým kovem, detektor elektronového záchytu.

D.- 1. Tepelně vodivostní detektor (TCD):

Jedná se o universální nedestruktivní detektor, je citlivý k plynům s nízkou molekulovou hmotností. Tepelně vodivostní detektor se skládá z platinové spirálky zasunuté do komůrky v kovovém bloku. Spirálkou prochází konstantní proud, který ji žhaví. Průtokem samotného nosného plynu je teplota spirálky ustálena. Jestliže se v nosném plynu objeví složka vzorku vystupující z kolony, dojde ke změně odvodu tepla a tím ke změně teploty spirálky, což vyvolá úměrnou změnu elektrického odporu. TCD jsou konstruovány obvykle se dvěma spirálkami, přes měrnou prochází nosný plyn s rozdělenými složkami vzorku, přes druhou, referentní část prochází pouze čistý nosný plyn. Pro tento typ detektoru vyhovuje nejlépe použití nosných plynů s dobrou tepelnou vodivostí, což jsou především vodík a helium.

D.- 2. Plamenový ionizační detektor (FID):

Plamenový ionizační detektor se řadí do základní výbavy plynového chromatografu. Jedná se o destruktivní detektor. Princip detekce spočívá v měření změny ionizačního proudu vodíkového plamínku v důsledku přítomnosti eluované složky vzorku. Vzniklé ionizované částice zaplňují prostor mezi elektrodami a snižují jeho odpor, takže může procházet proud. FID dává dostatečně velkou odezvu na téměř všechny organické látky. Běžně užívané nosné plyny dávají nízkou, téměř neregistrovatelnou odezvu. FID má největší lineární rozsah z běžně užívaných detektorů.

D.- 3. Termoionizační selektivní detektor (TSD, AFID, NPD)

Tento typ detektoru je modifikací FID, jedná se o selektivní termoionizační detektor s alkalickým kovem (AFID). Modifikace spočívá v umístění perličky nebo prstence se solí alkalického kovu v prostoru hořáčku (používají se hlavně síran sodný, chlorid draselný, bromid cesný, chlorid rubidný), detekce je založena na ionizaci alkalického kovu vlivem spalin organické látky. Detektor je znám také jako dusík/fosfor (NPD), protože dochází k selektivní ionizaci organickými sloučeninami obsahujícími atomy dusíku nebo fosforu.

D.- 4. Fotoionizační detektor (PID)

Fotoionizační detektor je rovněž modifikací FID detektoru. Energie pro ionizaci je získávána prostřednictvím UV lampy. Detektor je jen zřídka využíván, protože má nižší mez detekce než FID.

D.- 5. Heliový detektor (HeD):

Činnost detektoru je založena na ionizaci složky vzorku do něj vstupující z kolony atomy helia vybuzenými do metastabilního stavu o vysokém ionizačním potenciálu. Detektor je využíván především při analýzách permanentních plynů.

D.- 6. Detektor elektronového záchytu (ECD):

Jako nosný plyn se u tohoto typu detektoru používá dusík nebo argon, oba plyny se snadno ionizují měkkým beta-zářením (zdrojem bývá tricium nebo 63Ni). V ionizovaném nosném plynu jsou přítomny pouze elektrony zachytitelné nízkým elektrodovým potenciálem. Obsahuje-li nosný plyn složku s velkou elektronovou afinitou, dojde k pohlcení některých energeticky chudých elektronů, pohyblivost těchto nově vzniklých záporně nabitých částic je mnohem menší ve srovnání s volnými elektrony a je tedy vyšší pravděpodobnost jejich srážky s kladně nabitými částicemi. Rekombinací dojde ke snížení celkového počtu negativních částic a tím i ke snížení hodnoty ionizačního proudu.

D.- 7. Hmotnostní detekce (GC-MS):

Spojení plynového chromatografu s hmotnostní detekcí je určena samostatná kapitola.

E. Termostaty

Jednou z kritických veličin v plynové chromatografii je teplota a její stabilita, na ní závisí přesnost a reprodukovatelnost měřených údajů. Je nutno udržovat zvolený konstantní teplotní režim nástřiku, kolony, detektoru a regulátoru tlaku a průtoku. Termostat by měl umožňovat udržovat teplotu v rozmezí 100 - 500 °C. Teplovzdušné termostaty jsou vybaveny nucenou cirkulací vzduchu, což umožňuje provádět rychlé změny teploty. U většiny aplikací metod plynové chromatografie se uplatňuje postup s programovanou změnou teploty, reprodukovatelnost teplotního gradientu se odráží především ve stabilitě retenčních časů píků jednotlivých složek analyzované směsi.

F. Zpracování signálu detektoru a ostatních informací

Zpracování dat a tím kvalitativní i kvantitativní interpretaci analýzy lze provést v jednodušším případě zařazením integrátoru do sestavy plynového chromatografu, častějším vybavením je však v současné době již ovládání chromatografického systému počítačem. Softwarové vybavení obvykle registruje všechny pracovní podmínky (teplotní režim, regulace tlaku a průtoku), eviduje pořadí analýz, počet opakování, měří eluční časy a plochy píků jednotlivých složek vzorku, koriguje nulovou linii, řeší případy neoddělených látek vytvářejících složený pík apod.

G. Příprava vzorků

Příprava biologického materiálu před vlastním provedením analýzy metodou plynové chromatografie odpovídá schématu popsanému v kapitole CHROM. Po izolaci, případně i zakoncentrování hledaných složek extrakčními postupy se zpravidla v plynové chromatografii používá derivatizační postup. Chemická modifikace umožňuje rychlý přechod vzorku do plynného stavu, zvyšuje selektivitu, detekovatelnost.

OSN-SAutorské poznámkyOSN-E

Jaroslava Vávrová