OSN-SAbstraktOSN-E

Nekompetitivní imunoanalytická metoda stanovení analytů pomocí dvojice protilátek, jedna z protilátek je značena radioizotopem.

OSN-SSouvisející informaceOSN-E

OSN-STextOSN-E

Imunoradiometrická analýza (IRMA)

Jedná se o nekompetitivní metodu, kde stanovovaná látka (například antigen - Ag) reaguje s nadbytkem vazebného činidla označeného radioindikátorem (specifická protilátka - Ab*).

Průběh reakce lze zjednodušeně popsat:

Ag   +   Ab*     à     Ag-Ab*   +   Ab*

Ke kvantifikaci slouží označená protilátka. Množství komplexu [Ag-Ab*] je úměrné množství stanoveného antigenu, tedy se vzrůstající koncentrací stanovované látky vzrůstá také odezva (pokud je měřena vázaná frakce indikátoru), tj. radioaktivita vytvořeného komplexu.

V praxi není obvykle používán výše popsaný jednoduchý princip nekompetitivní reakce. Častější modifikací je tzv. "two-site" IRMA, také označovaná jako sendvičová IRMA.

Do reakce se stanovovaným antigenem vstupují v nadbytku dvě specifické protilátky jako vazebné regens. Každá z nich je namířena proti jiné antigenní determinantě antigenu, přičemž jen jedna je vhodným způsobem označena a slouží tak jako indikátor průběhu reakce.

První protilátka bez indikátoru Ab₁ bývá označována také jako "vychytávací" ("capture antibody"), druhá - Ab₂* - jako protilátka signální.

U IRMA metod se výrazným způsobem uplatnily tzv. specifické monoklonální protilátky. Schematicky je pak možno princip této metody popsat následujícím způsobem:

Ab₁   +   Ag   +   Ab₂*     à     Ab₁-Ag-Ab₂*  +   Ab₁   +   Ab₂*

Pro vyhodnocení výtěžku reakce je třeba separovat vázanou frakci indikátoru, tedy komplex [Ab₁-Ag-Ab₂*], od frakce volné, tj. nezreagované značené protilátky Ab₂*. Neznačená protilátka bývá většinou zakotvena na stěnu reakční zkumavky, nebo na jinou pevnou fázi (partikule, kuličky,…). Tím zůstává rovněž celý komplex přichycen k pevné fázi, což podstatným způsobem usnadňuje separační krok. z Nevyužitý nadbytek protilátky je z reakční směsi odstraněn obvykle pouhým odsátím nebo dekantací a propláchnutím vhodným promývacím pufrem.

Množství vzniklého značeného komplexu [Ab₁-Ag-Ab₂*] je i v tomto případě úměrné množství určovaného antigenu. Kvantitativní hodnocení se provádí pomocí analýzy sady vzorků se známou koncentrací analytu (kalibrátorů). Z kalibrační křivky, kterou je závislost změřené radioaktivity (osa y) jako funkce koncentrace stanovovaného antigenu (osa x), je potom odečtena koncentrace analyzovaného vzorku. Kalibrační křivka má tvar stoupající závislosti, v určitém rozsahu koncentrací má více či méně lineární charakter.

Praktické provedení IRMA metod může být realizováno jako "jednokrokové", kdy jsou obě protilátky přidávány do reakční směsi současně, nebo "dvoukrokové" (sekvenční), kdy jsou přidávány postupně. V prvním případě bývá pracovní rozsah metody (rozsah koncentrací kalibrační křivky) zásadně omezen možným vlivem tzv. "Hook efektu".

Nepřímá „two-site“ IRMA je další modifikací a zdokonalením základní metody IRMA. Používá stejného principu jako „two-site“ IRMA, avšak jako indikátor zde není použita protilátka Ab₂, ale pro detekci je do systému přidána třetí protilátka (Ab3*), která je vhodně označena. Závěrečnou fázi metody lze schématicky znázornit jako:

Ab₁-Ag-Ab₂   +    Ab₃*     à      [Ab₁-Ag-Ab₂]-Ab₃* + Ab₃*

OSN-SAutorské poznámkyOSN-E

Vladimír Bartoš

.