Abstrakt
Semikvantitativní stanovení bilirubinu v moči testačním proužkem. Uvedeny reakční principy, citlivosti a porovnání nejběžněji používaných proužků. Stručně uveden metabolismus, fyziologie a patofyziologie bilirubinu v těle.
Odkazy na jiné relevantní dokumenty, další informace
Návod na chemické vyšetření moče
Fyziologická variabilita
Metabolismus bilirubinu u novorozenců je odlišný od dospělých (Masopust, 1990). 75 % bilirubinu je tvořeno z fyziologicky se rozpadajících erytrocytů a 25 % z neefektivní erytropoezy či tkáňových hemových proteinů. Z těchto důvodů je tvorba bilirubinu proti dospělým asi dvojnásobná. Současně je zvýšena jeho enterohepatální nabídka (nedostatek bakteriální flóry, vyšší aktivita beta-glukuronidázy). Zároveň je ale pro nezralost konjugačních systémů snížena schopnost tvorby přímého (rozpustného) bilirubinu. Důsledkem je tedy především hyperbilirubinemie, která fyziologicky vrcholí 3.- 5. den po porodu a vymizí 11. až 12. den.
Patofyziologické mechanismy ovlivňující koncentraci
Konjugační kapacita jater pro bilirubin (aktivita glukuronyltransferázy) je v normě využita asi na 1/3. K zvýšení celkového bilirubinu v séru (ikteru) tedy dochází až při trojnásobku běžné produkce bilirubinu. Většinou jde o hemolytické stavy různé etiologie. Do moče proniká pouze konjugovaný (přímý) bilirubin jako prakticky bezprahová látka. Za normální produkce bilirubinu tvoří podíl konjugovaného bilirubinu na celkové bilirubinemii pouze asi 1 - 2 %. Průkaz bilirubinurie tedy svědčí vždy pro zvýšení přímého bilirubinu v séru.
Kritéria patologické novorozenecké hyperbilirubinemie:
a) ikterus se objeví už v prvních 24 hodinách
b) sérový bilirubin stoupá o 85 µmol/l za 1 den
c) sérový bilirubin je vyšší u donošených než 220 µmol/l, u nedonošených než 256 µmol/l
d) sérový bilirubindiglukuronid (přímý bilirubin) je vyšší než 25 - 34 µmol/l
e) ikterus přetrvává jeden týden u donošených nebo dva týdny u nedonošených
Přímé následky abnormálních koncentrací
U novorozenců je tato konjugační kapacita pro bilirubin z důvodu nezralosti konjugačního systému snížena (fyziologický novorozenecký ikterus, varovné hodnoty svědčící pro fetální erytroblastosu a možnost poškození CNS jsou v (Masopust, 1990).
Referenční intervaly
Masopust, 1990 uvádí jako horní mez fyziologické bilirubinurie 7 µmol/l. Z toho by bylo možné nesprávně odvodit přibližně stejnou fyziologickou hodnotu přímé bilirubinemie (asi 1/3 horní hranice celkového sérového bilirubinu tj. 22 µmol/l). Toto je ale již zřetelně patologická hodnota, protože u zcela zdravé osoby je podíl přímého bilirubinu v séru na celkové bilirubinemii jen asi 1 - 2 %.
Hodnoty detegované v moči proužkem Combur Test (citlivost asi od 3 - 4 µmol/l) jsou tedy zřetelně patologické - viz část "Použití pro klinické účely".
Omezení stanovení
Referenční (kontrolní) materiál nelze připravit z důvodů nestability konjugovaného bilirubinu v matrix s normálním pH a iontovou silou. Proto se nejčastěji užívá moče pacientů s patologickými hodnotami, které jsou analyzovány různými typy proužků. Metoda pro kvantitativní stanovení bilirubinurie (analogicky se sérovým stanovením) není vypracována, používá se proto nejčastěji kvalitativní tzv. Harrison spot test s citlivostí mezi 0,085 - 1,7 µmol/l (DH Report, 1996).
Specificita - citlivost je snížena při velkých množstvích askorbátu (podávání vitaminu C) a nitritů (vysoká bakteriurie) v moči, a dále stejně jako u urobilinogenu při delším stání moči (oxidace). Falešně pozitivní výsledky dávají opět látky barvící moč červeně (fenazopyridin).
Analytická senzitivita - pokud není uvedeno jinak, údaje platí pro COMBUR 10 TEST M (Roche)
Multicentrická studie (Gamble, 1994) zmiňuje dobrou srovnatelnost fotometrického a vizuálního odečtu (stejně jako v řadě dalších případů nad 90 %). Začátek reflektance (60 % rem) a její pokles je v počátcích pozitivity dosti strmý s první cut-off hodnotou na 55 %. Je tedy nutno Miditron mimo defaultové originální nastavení většinou dodatečně firemně dobře seřídit tak, aby výsledky nebyly často falešně pozitivní a přitom byla zachována přiměřená senzitivita. Možnost pozitivní reakce je při běžném nastavení již pod 7 µmol/l.
Při komparaci proužků hlavních producentů (DH Report 1996) byly konstatovány následující parametry :
Deklarované hodnoty:
Ames Multistix 10SG (Ames-Bayer) (diazotovaný dichloranilin v silně kyselém prostředí), hodnocení negativní až +++. Odečet za 30 s, senzitivita 3,4 - 6,8 µmol/l.
Combur 10 test M (Roche) (2,6 dichlorbenzen-diazonium fluoroborát), hodnocení v µmol/l, odečítací čas 60 s, senzitivita 9 µmol/l (dle našich zkušeností od 3 - 4 µmol/l)
heptaPHAN (Lachema a.s.) (triazen v kyselém prostředí), hodnocení neg až +++, odečítací čas 60 s, senzitivita 3 - 4 µmol/l
CSCD Maxiscreen Combi 5 (neurčená diazoniová sůl v kyselém prostředí), hodnocení neg až ++++, odčítací čas 30 - 60 s, senzitivita 8,5 - 7 µmol/l
Objektivní hodnocení (DH Report, 1966) ve srovnání s Harrison spot testem:
Nejvíce korespondovaly hodnoty proužku Maxiscreen, méně citlivé byly proužky Ames a Combur, nejméně citlivé heptaPHAN. Je ale důležité připomenout, že vyjadřování pozitivity v + má různé rozsahy škál a nepochybně i různé objektivní koncentrace v µmol/l.
Subjektivní hodnocení je nejobtížnější a také nejvýznamnější mezi negativitou a první pozitivitou. U všech proužků je malá barevná diference, vizuálně hodnotitelná se značnými subjektivními rozdíly.
Závěr tohoto hodnocení zdůrazňuje, že pro poměrně blízké barevné přechody je při hodnocení křížky blíže realitě škála s menším počtem hodnot (negativní ..+..++).
Dále je třeba zdůraznit, že někdy kontrolně používaná reakce s alkoholovým roztokem jódu (převrstvení moči s oxidací bilirubinu na zelený prstenec biliverdinu) je podstatně méně citlivá (až od 170 µmol/l) a má tedy teoreticky význam jen při údajích o možné vysoké koncentraci látek interferujících se stanovením na proužku (především askorbát).
Znaky analytické metody
Meze stanovitelnosti, meze detekce, diskriminační meze pokud není uvedeno jinak, platí pro COMBUR 10 TEST M (Roche Boehringer Mannheim)
Detekční proužek má 4 pásma, negativní = bledá barva - 10 - 30 - 60mg/l (červenofialová barva), což odpovídá negativní - 17 - 50 - 100 µmol/l. Dolní limit detekce v moči je 5 mg/l (9 µmol/l) bilirubinu v moči neobsahující kyselinu askorbovou. Průvodní literatura výrobce ale udává, že " za příznivých okolností" lze detekovat jako slabou pozitivitu už koncentrace od 2 mg/l (3 µmol/l). Pro sérum udává výrobce dolní limit detekce asi 8 mg/l (17 µmol/l), tj. možnost záchytu ještě fyziologické celkové bilirubinemie (do 22 µmol/l). Pro stanovení bilirubinu v séru nejsou ale detekční proužky samozřejmě určeny.
Bili PHAN Lachema
Hodnocení je ve vizuální stupnici ve formě 0 až +++.
Poznámka: dříve používaná zkouška s Ehrlichovým aldehydovým reagens je nespecifická, obdobně jako bilirubin reaguje sterkobilinogen, indikán a jsou časté lékové interference.
Použití pro klinické účely
Z patofyziologického hlediska je nutné připomenout, že do moče přechází jen konjugovaný bilirubin, který tvoří za normálních podmínek jen asi 1 - 2 % celkového bilirubinu. V publikaci (Masopust 1990) je uvedena patologická přímá bilirubinémie až od hodnoty 7 µmol/l, což zdůvodňuje výše uvedený problém citlivosti proužků.
Ze studií s velkým souborem pacientů (Ko, 1996 a Wilson, 1996) vyplynula relativně malá výpovědní hodnota stanovení bilirubinu a urobilinogenu v moči pro diagnostiku hepatopatií. Je to dáno zřejmě tím, že konjugovaný bilirubin se objevuje v séru a tím i v moči až při pokročilejších stadiích některých hepatopatií. Screening pacientů z hlediska využití žlučových barviv v moči byl v práci (Ko, 1996) podroben značné kritice. Korelací s dalšími laboratorními a klinickými parametry bylo zjištěno, že bilirubinurie (neuvádí se typ detekčního proužku) vykazuje s ohledem na přítomnost jaterní dysfunkce nízkou senzitivitu (18 % ve srovnání se sérovými enzymy a 31 % při srovnání se sérovým bilirubinem). Z hlediska prediktivní hodnoty má až 41 % pravděpodobnost selhání v detekci hepatopatií. Ovšem naopak je při pozitivním nálezu bilirubinurie pravděpodobnost jaterního onemocnění nad 90 %. Ještě horší údaje společně pro bilirubin a urobilinogen v moči byl uveden v (Wilson, 1996). Při použití systému Multistix Ames-Bayer/Clintek autoři nalezli u 138 pacientů se sérovými abnormalitami svědčícími pro hepatopatii senzitivitu vyšetření moče pro oba analyty proužkem jen 9,5%, specifitu 95%, pozitivní prediktivní hodnotu 28 % a negativní 78 %. Přitom při zvýšení sérového bilirubinu byla nalezena pozitivita močového bilirubinu a nebo urobilinogenu jen v 18 % případů. Naopak při 32 pozitivních nálezech těchto látek v moči nebyla v podstatě nalezena žádná hematologická nebo hepatologická patologie tj. šlo o falešnou pozitivitu. Sami jsme učinili podobnou, i když ne tak dramatickou zkušenost s falešnými pozitivitami (časté reklamace u asymptomatických jedinců při příliš nízkém prahu pozitivity).
Přes uvedené výhrady i nadále platí, že každá pozitivita nálezu bilirubinurie je významná a tím důležitější je analytické nastavení dolní hranice detekce. Pokud je současně odebrána krev, je vhodné korelovat pozitivní močový nález s kvantitativním hodnocením celkového a zejména konjugovaného bilirubinu v séru. =Vysoké pozitivity zpravidla diagnostické potíže nečiní. U novorozeneckého ikteru je z hlediska rizika poškození CNS - mimo další kriteria (Masopust, 1990) - varovná sérová hodnota konjugovaného bilirubinu nad 34 µmol/l (celkového bilirubinu nad 220 µmol/l u donošených a 256 µmol/l u nedonošených) a bude se tedy v těchto případech vyskytovat častá pozitivita i v moči.
Detekčními proužky lze někdy stanovit i hodnoty nižší, než jsou běžně udávané referenční meze (7 µmol/l). Lze z toho vyvodit, že odpovědnost v nastavení senzitivity reflexních fotometrů, tj. cut-off hranice mezi negativitou a první pozitivitou, je značná.
Literatura
1. Masopust, J.: Požadování a hodnocení biochemických vyšetření. Zdravotnické aktuality 216, Avicenum 1990
2. Colombo, J.P., Peheim, E.: s. 103- 132. In: Klinisch-chemische Urindiagnostik. Ed. Colombo J.P., LABORLIFE Verlaggemeinschaft.
3. Urinanalysis with test from Boehringer Mannheim. Firemní tisk.
4. Nejedlý, B.,Tobiška, J.,Zahradníček, L.: Základní a morfologické vyšetření moče. Účelová publikace ministerstva zdravotnictví ČSR 1988
5. Gambke, B. etal.: Miditron (Multicenter Evaluation - Workshop. Klin.Lab.40, 1994, s. 262-268
6. Ko, R.W. : The Effectivnessof the Urine Dipstick as a screen for Liver Dysfunction. AACC/CSCC Annual Meeting, July 28-August 1, 1996. Clin.Chem. 42 (Suppl.6), 1996, S188.
7. Wilson D.M.: Utility of dipstick urine urobilinogen and bilirubin in a subspeciality/general medical clinic. AACC/CSCC Annual Meeting, July 28-August 1, 1996. Clin. Chem. 42 (Suppl.6), 1996, S 775.
8. DH Report - Urine reagent strips, 1996, firemní materiál Roche Boehringer Mannheim.
Autorské poznámky
poslední revize 10. 9. 1997, Zdeněk Mašek
WIN revize 31. 5. 1999 Gustav Louženský