Abstrakt
Fluoroimunoanalytická metoda vyvinutá firmou Wallac Oy
(LKB). Pomocí této metody lze stanovit nízko i vysokomolekulární analyty. K detekci se používá
časově modulované měření fluorescence chelátu
lantanidů (Eu, Sm, Tb).
Související informace
Text
Imunocheimická reakce může mít kompetitivní i
nekompetitivní uspořádání. V prvém případě je fluorescenční sondou značen antigen, v druhém případě
protilátka. Pracuje se v mikrotitračních destičkách v uspořádání 8x12 jamek o
objemu 0,3 ml s jednou specifickou protilátkou (obvykle monoklonální) nebo antigenem
vázaným na pevné fázi. Druhá protilátka je označena chelátem lantanidu.
Fluorescenční sonda je tvořena nejprve velmi stabilním chelátem. Po proběhlé
imunochemické reakci se tento chelát přemění na sloučeninu se silnou
fluorescencí (přídavek diketonu, detergenčního činidla a vytvoření silně kyselého prostředí). Takto
vzniklá sloučenina má dlouhodobou fluorescenci (řádově stovky mikrosekund) s
velkým Stokesovým posunem fluorescenčního spektra (rozdíl mezi vlnovou délkou
excitace a fluorescence). Fluorescence se měří v červené části viditelného spektra (620 nm).Vzorek
je pulsně excitován určitou vlnovou délkou světelného záření (např. 340 nm) s frekvencí okolo 1
milisekundy. Detekce fluorescenčního záření se pomocí složité elektroniky začne
měřit se zpožděním stovek mikrosekund a měření skončí např. za 200 až 400
mikrosekund. Tím se eliminuje fluorescence matrice biologického materiálu, která
je podstatně kratší - v řádu nanosekund. Měření se provádí opakovaně a
načítá se za vybraný časový interval 1000 a vícekrát. Za jednu sekundu se dá načítat 1000
měření při frekvenci excitace 1 milisekunda. Do prvních jamek se pipetují kalibrátory. Pomocí
těchto kalibrátorů se sestrojí kalibrační křivka, podle které se odečítají
jednotlivé analyzované vzorky. Tento systém je univerzální umožňuje analýzy
nízko i vysokomolekulárních látek. Zejména v nekompetitivním uspořádání může výrazně
zlepšit citlivost imunoanalýzy.
Poznámky
DELFIA - Dissociation-enhanced lanthanide
fluoroimmunoassay. Firemní označení patentovaného systému firmy Wallac Oy (Pharmacia-LKB).
Appendixy
Literatura
Firemní materiály Pharmacia LKB R. Peacock: Time-resolved
fluorescence: A Major Advantage in Nonisotopic Immunoassay. International
Clinical Products Review September/October 1985.
Autorské poznámky
Autor: Šafarčík Kristian
Datum
aktualizace:31.7.1998