OSN-SAbstraktOSN-E

Chromatografické techniky spočívají v různých fyzikálně-chemických principech dělení směsi látek na jednotlivé složky. Mechanismus chromatografického dělení využívá zadržení (retenci) směsi stacionární fází a postupné a opakované vytváření rovnovážných stavů dělených látek mezi přítomnými fázemi.

OSN-SSouvisející informaceOSN-E

OSN-STextOSN-E

Základní informace o chromatografických technikách jsou rozděleny podle schématu:

1. Chromatografické metody - úvod, přehled

2. Faktory ovlivňující chromatografické dělení

A. Termodynamické faktory separace

B. Kinetické faktory separace

3. Základy hodnocení chromatografických dat

4. Příprava vzorků

5. Derivatizace

1. Chromatografické metody - úvod, přehled

Principiální základ všem chromatografickým technikám položil na počátku dvacátého století M.S. Cvet (1872 - 1919), ruský botanik, fyziolog a biochemik, když rozdělil na sloupci sorbentu listová barviva.

Přehled chromatografických metod

Mobilní fáze	Stacionární fáze	Mechanismus dělení	Metoda
plyn	kapalina	rozdělování, rozdělovací,	plynová rozdělovací
		rovnováha	chromatografie (GLC)
	pevná látka	adsorpce, adsorpční	plynová adsorpční
		izoterma	chromatografie (GSC)
		sítový efekt	plynová chromatografie
			na molekulových sítech (GSC)
kapalina	kapalina	rozdělování, rozdělovací	kapalinová rozdělovací
		rovnováha	chromatografie (LLC)
		sítový efekt	gelová permeační
			chromatografie (GPC)
	pevná látka	adsorpce, adsorpční	kapalinová chromatografie
		izoterma	adsorpční (LSC)
			tenkovrstvá
			chromatografie (TLC)
		iontová výměna,	ionexová chromatografie
		výměnná rovnováha	(IEC)
		biospecifická chemická	afinitní
		chemická reakce	chromatografie

Stacionární (nepohyblivá) fáze - je umístěna v koloně (vrstvě), může být představována částečkami pevné hmoty ( stacionární fáze v kapalinové chromatografii ) nebo kapalinou zakotvenou na povrchu inertního nosiče.

Mobilní (pohyblivá) fáze - (plyn, kapalina) unáší separované složky ložem stacionární fáze.

2. Faktory ovlivňující chromatografické dělení

Termodynamické faktory separace

Termodynamické faktory separace zahrnují vliv interakce chromatografovaných složek se sorbentem a z toho vyplývající i rozdílné mechanismy separace. Hlavními principy chromatografického dělení jsou adsorpce, rozdělování mezi dvě fáze, chemisorpce a sítový efekt.

(a) Adsorpce na polárních adsorbentech a chemisorpce

Při adsorpci molekul na tuhých adsorbentech dochází k jejich zachycování na povrchu tuhé fáze. Jestliže pronikají přes rozhraní tuhé fáze a difundují do jejího objemu, jedná se o adsorpci. Rozhodující význam při adsorpci má velikost a jakost povrchu adsorbentu, kde se nachází tzv. adsorpční centra. Závislost adsorbovaného množství látky na koncentraci téže látky v okolním prostředí udává adsorpční izoterma. V reálných systémech se uplatňují dvě izotermy, a to Langmuirova a Freundlichova.

(b) Rozdělování mezi dvě nemísitelné fáze

Tento mechanismus převládá v plynové chromatografii. Dostanou-li se do styku dvě nemísitelné fáze (obě kapalné, nebo kapalná a plynná) z nichž jedna obsahuje určitou složku (směs látek) a druhá nikoli, difunduje tato do čisté fáze tak, aby byl zachován určitý poměr, který je za daných podmínek konstantní. Hnací silou tohoto partičního procesu je rozdíl koncentrací složky v jedné a druhé fázi, protože systém má snahu dostat se do rovnováhy.

(c) Sítový efekt

Na principu sítového efektu jsou založeny dvě techniky. V plynné fázi je to chromatografie na molekulárních sítech využívající rozdílných, přesně definovaných pórů sorbentu k separaci plynů podle velikosti průměru jejich molekul či atomů. V kapalné fázi jde o gelovou permeační chromatografii .

(d) Vzájemná interakce molekul

Sorpce látek je podmíněna silami, jimiž na sebe působí navzájem sorbent a sorbovaná látka. Jedná se o síly nepolární (van der Waalsovy) a polární (indukované, disperzní, vazebné), které se mohou uplatňovat (interakce vzorek - vzorek, vzorek - sorbent, vzorek - mobilní fáze).

Kinetické faktory separace

Kinetické faktory zahrnují vlivy rychlosti průtoku mobilní fáze, difúze složek v mobilní i stacionární fázi atd. na rozšiřování elučních křivek. K vystižení těchto vlivů se zavádějí pojmy teoretické patro, kapacitní poměr, účinnost a další. Míra relativní separace dvou látek se nazývá rozlišení. Rozlišení je závislé na vztahu mezi selektivitou, kapacitou a účinností.

(a) Teoretické patro

Teoretické patro je mírou účinnosti chromatografického systému, bezprostředně s ní souvisí tvar eluční křivky. Vlivy difúze během chromatografických pochodů se projevují rozšiřováním eluční křivky. Je-li známa celková délka kolony (L), je možno vypočítat výšku (H) ekvivalentní teoretickému patru, na jejímž základě se porovnávají účinnosti jednotlivých chromatografických kolon.

(b) Difúzní teorie

Tato teorie respektuje neideální chování složek v chromatografické koloně a připisuje projevy tohoto chování třem hlavním vlivům: turbulentní difúzi v mobilní fázi (H_T), molekulární difúzi v mobilní fázi (H_M) a odporu vůči převodu hmoty na fázovém rozhraní (H_O). Tyto vlivy jsou nezávislé a podílí se na výšce ekvivalentní teoretickému patru:

H = H_T + H_M + H_O

Souvislost mezi difúzními vlivy a lineární rychlostí mobilní fáze odvodil van Deemter. V nejjednodušším tvaru má van Deemterova rovnice tvar:

H = A + B/u + C * u

kde: A - faktor vlivu turbulentní difúze, B - faktor vlivu molekulární difúze, C - faktor vlivu odporu vůči převodu hmoty, u - střední lineární rychlost toku mobilní fáze.

(c) Rozlišení

Cílem chromatografie je dosáhnout dobrého rozdělení analyzovaných látek v přijatelném čase. Rozdělení může být úplné, částečné, nedokonalé. Kvantitativně je zavedena míra relativní separace dvou látek a nazývá se rozlišení R_1,2.

Z praktického hlediska je třeba vědět, jak lze rozlišení měnit, které faktory a jak hodnotu rozlišení ovlivňují:

R_1,2 = F_selektivity * F_kapacity * F_účinnosti

Faktor selektivity

Selektivita systému daná volbou stacionární a mobilní fáze hraje v chromatografii rozhodující úlohu. Separace složek u instrumentálně nejjednodušších technik jako jsou papírová a tenkovrstvá chromatografie je založena pouze na selektivitě systému. Selektivní faktor je faktorem termodynamickým a je někdy vyjadřován pomocí separačního faktoru a, který je roven poměru distribučních konstant. Lze odvodit, že rozlišení je úměrné výrazu (1 - a).

Hodnotu rozlišení je možno ovlivnit:

- změnou stacionární fáze,

- změnou mobilní fáze,

- současnou změnou obou fází,

- změnou rychlosti toku mobilní fáze.

Faktor kapacity

Kapacitní poměr k je bezrozměrná veličina udávající hodnotu retence separované složky:

k = K_D * V_s/V_m

kde: K_D - distribuční konstanta, V_s a V_m jsou objemy stacionární a mobilní fáze.

Hodnota rozlišení roste se vzrůstající hodnotou kapacitního poměru. Kapacitní poměr lze ovlivnit:

- množstvím stacionární fáze v koloně,

- změnou stacionární nebo mobilní fáze (v HPLC gradientovou elucí),

- změnou teploty kolony (v GC stupňovitá i gradientová).

-

Faktor účinnosti

Faktor účinnosti je faktorem kinetickým a ukazuje, že rozlišení je úměrné druhé odmocnině celkového počtu pater kolony. Faktor účinnosti lze ovlivnit:

- délkou kolony,

- rychlostí průtoku mobilní fáze,

- velikostí částic sorbentu,

- teplotou, viskozitou mobilní i stacionární fáze apod.

3. Základy hodnocení chromatografických dat

Vyjadřování výsledků ve všech kolonových chromatografických technikách je shodné. Po nástřiku vzorku do chromatografické kolony je unášen eluční pás (směsná zóna) mobilní fází a na koloně naplněné sorbentem dochází k jejich separaci (rozdělení). Při výstupu složky směsi z kolony indikuje detektor její přítomnost v eluátu a zaznamenává graficky eluční pík (křivku). Poloha píku udává dobu, kterou separovaná složka setrvá v koloně, tj. eluční (retenční) čas a je kvalitativním průkazem přítomnosti dané složky. Plocha (výška) píku se kvantifikuje a udává množství složky obsažené v separované směsi.

Při kvantitativní analýze je třeba řešit vztah mezi plochou (výškou) píku a množstvím složky ve vzorku a získané výsledky hodnotit z hlediska přesnosti a správnosti. Pro určení obsahu složky analyzovaného vzorku se používá:

a. Metoda absolutní kalibrace (metoda vnějšího standardu) spočívá v dávkování známých množství analyzovaného vzorku a standardu za identických podmínek a to buď metodou kalibrační křivky nebo metodou přímého srovnání.

b. Metoda vnitřního standardu je založena na přidání známého množství jedné látky, která neinterferuje s ostatními složkami směsi. Tato metoda eliminuje případné nepřesnosti v dávkování vzorku nebo ztráty při předúpravě vzorku.

c. Metoda standardního přídavku využívá přidání definovaného množství standardu ke známému množství vzorku.

4. Příprava vzorků

Kromě vlastního analytického zpracování vzorků jsou výsledky analýz značně ovlivněny i způsobem odběru a dalším zpracováním vzorků před analýzou.

Obohacovací techniky a úprava vzorků

Důvody pro použití:

- na chromatografickou kolonu nelze přímo dávkovat biologický materiál,

- koncentrace stanovované látky je pod limitem detekce,

- stanovovaná látka je doprovázena jinými látkami, které ruší analýzu.

Techniky úpravy vzorků:

1. adsorpční

2. metody využívající chemické reakce

3. vymrazovací (kryogenní)

4. odlučovací (trapping)

5. extrakční - plynem (headspace), pevnou látkou (SPE), kapalinou (extrakce mezi nemísitelnými kapalinami, destilační extrakční technika)

6. ultrafiltrační

V klinické chemii se používají hlavně techniky extrakční a ultrafiltrační, ostatní způsoby obohacování vzorků se uplatňují především v technické praxi.

Extrakční techniky:

(a) extrakce plynem

Pro postupy zahrnující obecně extrakci studovaného materiálu plynem a následující plynově chromatografickou analýzu plynného extraktu se vžil název headspace analýza. Jedná se o postupy, kterými se stanovují obsahy těkavých složek kondenzovaných materiálů analýzou plynné fáze, která je v kontaktu (zpravidla v rovnováze) s analyzovaným kondenzovaným materiálem. V klinické praxi je použitelná tzv. statická headspace, kdy se analyzuje vzorek plynu odebraný z prostoru nad kondenzovanou fází uzavřeného systému, který je s ní v rovnováze (např. analýza těkavých látek v krvi).

(b) extrakce kapalinou

Extrakce mezi dvěma nemísitelnými kapalinami využívá zákonitostí Nernstova rozdělovacího zákona. Základní podmínkou je dobrá rozpustnost sledovaných komponent v použitém rozpouštědle a také znalost velikosti distribučních konstant v daném systému. Organický extrakt se zpravidla odpařuje v proudu inertního plynu (dusíku) a odparek se rozpustí před aplikací na chromatografickou kolonu v nezbytném objemu mobilní fáze.

(c) extrakce pevnou látkou (SPE)

Technika izolace, čištění nebo obohacování stanovované složky na malých kolonkách (např. velikosti injekční stříkačky) naplněných sorbentem, iontoměničem, gelem nebo jiným dělícím médiem dle charakteru izolované látky. Vzorek v roztoku se prolévá nebo prosívá podtlakem, zachycené složky se po promytí uvolní vhodným rozpouštědlem.

Pro SPE se často využívá především modifikovaného silikagelu:

Typ sorbentu (vázaná funkční skupina)	Typ interakcí	Příklady aplikací
Silikagel O	adsorpce polárních látek	steroidy, lipidy, org. kyseliny,
	l	léčiva
oktadecyl-	RP* extrakce nepolárních a	steroidy, nitraminy
	středně polárních látek
kyanopropyl-	NP** extrakce polárních látek	aminy, alkoholy, barviva,
		fenoly
diol-	NP extrakce polárních látek	proteiny, peptidy
aminopropyl- (dimethylaminopropyl-)	extrakce na principu slabé iontové výměny	peptidy, nukleotidy, steroidy, vitamíny, cukry, aminokyseliny
aromatické sulfonové kyseliny	extrakce na silných katexech a RP extrakce (kromě mechanismu iontových párů)	aminokyseliny, katecholaminy, nukleové báze, nukleosidy
kvarterní aminy	extrakce na silných anexech	nukleosidy, nukleové kyseliny, antibiotika

** RP - systém obrácených fází

** NP - systém normálních fází

(d) Ultrafiltrace

Ultrafiltrace je metoda obohacování nebo dělení roztoků pomocí polopropustných membrán. Hustota membrány limituje velikost molekul, které jsou separovány. Tato technika je vhodná pro deproteinaci sérových vzorků, provedení je možné i v malých objemech vzorku (centrifugační filtrace ve zkumavkách typu Eppendorf).

5. Derivatizace

Derivatizační techniky využívají specifické reakce před, v průběhu chromatografického procesu, nebo po jeho ukončení před vstupem do detektoru. Smyslem je docílit kvalitativně nových vlastností separovaných látek, které umožní předseparaci či separaci vůbec, usnadní identifikaci, zvýší citlivost vlastní detekce. Každá z chromatografických technik klade na připravené deriváty jiné požadavky. U plynové chromatografie je třeba docílit toho, aby vznikající deriváty byly těkavější než látky původní, zatímco v kapalinové chromatografii v plošném uspořádání je tomu naopak. U kapalinové kolonové chromatografie nehraje tenze par separovaných složek významnou roli, ale jde především o vyvolání změn v rozpustnosti jednotlivých komponent obsažených ve směsi.

OSN-SPoznámkyOSN-E

OSN-SAppendixyOSN-E

OSN-SLiteraturaOSN-E

OSN-SAutorské poznámkyOSN-E

Jaroslava Vávrová