Abstrakt
Průkaz erytrocytů v moči chemicky testačním proužkem a semikvantitativní a kvantitativní hodnocení v centrifugované moči.
Morfologický odečet při mikroskopickém vyšetření
Jde o semikvantitativní stanovení počtu erytrocytů mikroskopicky v močovém sedimentu ve vzorku nesbírané moče.
Odkazy na jiné relevantní dokumenty, další informace
Chemické vyšetření moče
Patofyziologické mechanismy ovlivňující koncentraci
Rozlišuje se hemoglobinurie (hemurie) s exkrecí pouze krevního barviva (prerenální příčiny) a hematurie (erytrocyturie) s průkazem různých morfologických typů erytrocytů. Chemicky tato diferenciace není možná.
Z hlediska morfologické diagnostiky jde o
- erytrocyty s analogickou diskoidní morfologií jako v krvi. Je nutné si ale uvědomit, že jejich průměr klesá s rostoucí osmolalitou a klesajícím pH. První ranní moč má osmolalitu asi dvojnásobnou než sérum, ale vzhledem ke snadnému průniku vysoké koncetrace urey intracelulárně jsou zhruba stejně velké jako v krvi. Přesto je průměr erytrocytů v moči poněkud menší (asi 6 um). Při vysoké osmolalitě a nízkém pH se mohou najít malé svráštělé, "ostnaté" erytrocyty - akantocyty. Naopak při osmolalitě pod 300 mmol/kg a posunu pH na alkalickou stranu se průměr erytorcytů zvětšuje, až dochází k jejich lýze.
- sférocyty (kulovité erytrocyty o průměru 4 - 6 um), které mohou mít normální nebo zvýrazněný okraj (stomatocyty) Tyto dysmorfní erytrocyty mohou také určovat glomerulární původ erytrocyturii - viz dále.
- stíny erytrocytů ("ghost") jsou membrány zaniklých erytrocytů nebo erytrocyty, které ztratily větší část hemoglobinu.
Většinou se jako horní hranice normy udává hodnota do 1 erytrocytu na zorné pole mikroskopu při 400-násobném zvětšení (síla vrstvy není většinou zohledněna). Z důvodů uvedených v operačním postupu je nutné přejít na vyjadřování v 1 µl moče. Pak je odpovídající hodnota maximálně 10 erytrocytů na 1 µl moče ( ale spíše méně - viz definice arbitrárních jednotek)
Protože chemická detekce proužkem zejména při odečtení fotometrem má v nižších počtech jemnější stupnici (0 - 10 - 25 - 50 atd. na 1 µl moče, doporučujeme volit stejnou škálu pro vyjádření počtu při mikroskopickém vyšetření (příslušné hodnoty pro tradiční zorné pole pak jsou 0 - 1, 1 - 3 a 3 - 5 na zorné pole).
Je třeba zdůraznit, že detekce proužkem deteguje zhruba dvojnásobně lépe intaktní erytrocyty než množství volného hemoglobinu z nich uvolněného při jejich lýze.
Přímé následky abnormálních koncentrací
Při masivní makroskopické hematurii může docházet k tvorbě koagul a poruchám pasáže moči typu renální koliky. Při vysoké hemoglobinemii nebo myoglobinemii dochází k průchodu těchto proteinů do ultrafiltrátu a možnosti tubulární obstrukce (rhabdomyolýza).
Referenční intervaly
méně než 2 erytrocyty/µl ranní moče
Znaky analytické metody
Chemická detekce proužky - semikvantitativní odhad počtu erytrocytů v moči (stanovení hemoglobinu v erytrocytech a volného hemoglobinu nebo myoglobinu)
Diagnostika chemicky proužkem - jde o nepřímý semikvantitativní odhad počtu erytrocytů v moči, kdy principem je stanovení hemoglobinu v erytrocytech a volného hemoglobinu anebo myoglobinu. Provádí se detekčními proužky na bázi peroxidázové reakce, dalšími možnostmi je dříve používaná (a dnes pro kancerogenitu činidla opuštěná) benzidinová metoda nebo při detekci okultního krvácení ve stolici používaná guajakolová reakce. Má výhodu pozitivity i při lýze erytrocytů, která nastává zvláště při alkalickém pH a v hypotonické moči. Podrobnosti jsou v návodu na chemické vyšetření moče.
Pokud není uvedeno jinak, platí pro COMBUR 10 TEST M (Roche) jako příklad námi užívaného postupu.
Mez stanovitelnosti, mez detekce, diskriminační mez - detekční zóna obsahuje 4 zóny pro vizuální odečet, pro odečet Miditronem platí pětibodová škála: negativní (žluté pozadí ) - 10 - 25 (není při vizuálním hodnocení) - 50 - 150 (není při visuálním odečtení) - 250 erytrocytů na 1 µl moče (modrozelená barva).
Hodnoty uvedené v 1 µl moče dělené 10 odpovídají při mikroskopickém odečtení přibližně počtu erytrocytů na 1 zorné pole při použití síly vrstvy 100 um a zvětšení 400x. Dolní limit detekce je tedy značně nízký (5 erytrocytů/µl nebo množství volného hemoglobinu uvolněného při lýze z 10 erytrocytů/µl) a blíží se fyziologické erytrocyturii (0 - 3 erytrocyty/µl).
Přítomnost volného hemoglobinu a myoglobinu se projeví homogenním zabarvením zóny s poněkud nižší citlivostí. Hodnota 10 erytrocytů/µl odpovídá při volném Hb 10 - 30 erytrocytů/µl , 50 erytrocytů/µl = Hb uvolněný z 30 - 150 erytrocytů/µl, 250 erytrocytů/µl = Hb uvolněný z 150 - 300 erytrocytů/µl. Rozlišení myoglobinu od hemoglobinu není možné.
Analytická citlivost - test je založen na pseudoperoxidázové reakci hemoglobinu a myoglobinu, tj. oxidaci barevného indikátoru při rozkladu organického peroxidu (2,5-dimethyl-2,5-dihydroperoxyhexan). Ve svrchní vrstvě indikační zóny je navíc jodistan, oxidující případně přítomnou kyselinu askorbovou. Jsou přítomny dvě škály - pro hodnocení intaktních erytrocytů (disperzní mramorové zelené zabarvení) a pro přítomnost volného hemoglobinu.
Specificita - test je specifický pro hemoglobin a myoglobin, uspořádání vylučuje jinak častou interferenci s kyselinou askorbovou. Běžně nevadí přítomnost jiných elementů v moči, u masivní leukocyturie byla sice popsána zkřížená barevná reakce, ale firemní citace (10) naznačuje, že je dána zřejmě současnou přítomností hemoglobinu. Proteinurie nad 5 g/l může poněkud citlivost barevné reakce hemoglobinu snižovat. Pseudoperoxidázovou reakci může způsobit masivní přítomnost některých bakterií - nad 2,2 mmol/l nitritů při chemické detekci. Moč nesmí být konzervována formalinem, naopak test není ovlivněn přítomností jódu v moči. Falešně pozitivní výsledky mohou být dány přítomností silně oxidujících detergentů (špatný výplach sběrné nádoby po její dezinfekci).
Proti dřívějším testům má proužek Combur 10 Test M výhodu v oxidaci askorbátu v horní vrstvě detekční zóny a tato dosti častá interference a falešná pozitivita tedy odpadá.
Analytická spolehlivost - fotometrické odečtení umožňuje podrobnější rozdělení škály na 6 pásem, proto je shoda v hlavní diagonále při multicentrické studii (Gambke, 1994) o něco nižší než obvykle - 66,3 %. Podstatné je srovnání fotometrického hodnocení detekčního proužku s kvantitativním stanovením erytrocytů v Bürkerově komůrce ve stejné studii. Hodnoty na proužku byly středem pásem pro mikroskopické hodnocení a v hlavní diagonále byla zjištěna shoda 56,4 %, při zahrnutí obou laterálních pásem celkem 90,6 %. Také zde je velmi důležité nastavení prahové hodnoty reflektance (rem) z hlediska první pozitivity (10 erytrocytů na 1 µl odpovídá - 56 % rem). Posun cut-off hodnoty níže může vést k častějším pozitivitám, které je třeba korelovat s mikroskopickým nálezem. Při diferenci je třeba ale také zvážit možnost dodatečné lýzy elementů. Naše vlastní studie (7) ukázala značnou shodu v negativitách, ale asi 50% diferenci na první pozitivitě tj. 10 erytrocytů/µl, kde byla stejně častá mikroskopická hodnota 25 erytrocytů/µl. Při našem originálním nastavení Miditronu a použití vlastní kalibrace (přidání přesně definovaného počtu erytrocytů do moče) byla zjištěna vysoká analytická senzitivita. První pozitivita reakce detekčním proužkem a odečtu Miditronem byla již při 2,5 erytrocytech/µl moči (asi 70 pg hemoglobinu/µl moči). Při přítomnosti intaktních erytrocytů zvl. ve vyšších hodnotách se objeví nehomogenní zbarvení pole v první z obou škál a pak je chemická diferenciace hematurie vs. hemoglobinurie možná při event. naředění moči 1:10 či 1:100 fyziologickým roztokem.
Biologický rozptyl - slabá pozitivita je hlavním interpretačním problémem vzhledem k možné přítomnosti intermitetní hraniční erytrocyturie např. při IgA nefropatii, zvl. u dětí a adolescentů. Proto ji nelze přes možné výše popsané vlivy (nastavení citlivosti) podceňovat.
Dlouhodobou korelaci chemického stanovení s mikroskopickými nálezy na stejném pracovišti a zaznamenávání neshod v obou postupech je možné jen doporučit. Opět je nutné upozornění na možnost diferencí vzniklých lýzou intaktních erytrocytů s dodatečným uvolněním hemoglobinu a tedy na falešnou negativitu mikroskopického nálezu. Volný hemoglobin v plasmě se objevuje při hemolytických situacích při překročení vazebné kapacity haptoglobinu tj. při množství asi 1,0 g/l (60 umol/l). Pak je detegovatelný i v moči, aniž by byl známkou onemocnění ledvin či močových cest. Myoglobin v moči je detekován při zvýšení koncentrace v plasmě nad 0,15 - 0,20 g/l (9 - 12 umol/l). Hraniční situace nastávají někdy při drobných myonekrosách (excesivní fyzický výkon) a bývají většinou interpretovány jako hemoglobinurie (odlišení chemicky detekčním proužkem není možné).
Stanovení počtu erytrocytů a jejich morfologie mikroskopicky - semikvantitativní stanovení počtu a charakteru erytrocytů v močovém sedimentu ve vzorku nesbírané moče.
Při pH moče pod 7,5 a isoosmolalitě ( 300 mmol/kg = cca 1015 specifická hmotnost) mohou erytrocyty v moči udržet svůj tvar až 24 hodin. Každá změna močové matrix ale vede k výraznému zkrácení této doby.
Dolní limit detekce (fyziologická erytrocyturie) je uvažována různě - od hodnoty 0 - 1 (6) až do 0 - 5 erytrocytů na zorné pole (7) tj. od 10 do 50 erytrocytů na 1 µl moče. Hodnotu 4 - 5 na erytrocytů na zorné pole (40 - 50 erytrocytů v 1 µl moče) není možné považovat za hraniční.
Makroskopická hematurie se projeví červeným zbarvením moče nebo červeným pásem na dně sedimentu po odstředění. Nad počet 40 - 50 erytrocytů na zorné pole (400 - 500/µl moče) je hodnocení slovní (plné pole, záplava, shluky apod.). Odlišení erytrocytů od sférocytů - mají poněkud menší maximální průměr 4 - 6 um - není většinou zřetelné. Při nebarveném sedimentu se mohou spíše výjimečně erytrocyty zaměnit za kvasinky. Při isoosmolalitě moči (300 mmol/kg vody, tj. specifická hmotnost asi 1010) nejsou erytrocyty stejně velké jako v plasmě vzhledem k snadnému průniku vysoké koncentrace urey (50 % osmotické aktivity moči) intracelulárně.
Stejně velké jako v plasmě jsou při obvyklé osmolalitě ranní moči, tj. kolem 650 mmol/kg vody. Při pH nad 6,5 a specifické hmotnosti nad 1025 se erytrocyty mění na mikrocyty, při pH pod 6,5 a specifické hmotnosti pod 1010 se objevuje bobtnání až úplná lýza elementů, někdy s nálezem membrán (ghosts).
Ekonomické náklady
Cena vyšetření monofunkčním testačním proužkem HemoPHAN je ke dni 1.6.1999 0,84 Kč.
Použití pro klinické účely
Makroskopická hematurie znamená více než 2500 erytrocytů na µl moči a tedy maximální pozitivitu detekčního pole. Příčiny mikroskopické hematurie jsou uvedeny v nefrologických monografiích.
Schematicky jde o erytrocyturii (hematurii):
(a) prerenální - zvýšená koncentrace v plasmě - "overflow" hemoglobinurie a myoglobinurie. Důvody jsou hematologické, dále traumata, popáleniny apod.
(b) renální (glomerulární častější než tubulární), ale také při tumorech ledvin (Grawitz).
(c) z močových cest: urologické příčiny (urolitiáza, záněty, nádory aj.).
Původ erytrocytů lze odlišit buď speciálním sběrem (metoda 3 sklenic), nebo přesněji při jejich hodnocení mikroskopem s fázovým kontrastem nebo fluorescencí. Při instrumentálním odběru bývá často artificiální erytrocyturie a také možnost jejich neobvyklých morfologických změn. Nález v sedimentu hodnotíme ve vztahu k chemickému vyšetření s uvážením možných disproporcí při lýze erytrocytů nebo hemoglobinurii.
Vyšetření glomerulárního původu erytrocytů - důležité je rozlišení původu erytrocytů, tj. především diferenciální diagnóza glomerulárního či neglomerulárního původu.
a) metoda tří sklenic je v tomto směru pracná a při malé specifitě obsolentní
b) při pozitivitě chemické erytrocyturie nad 100/1 µl moče provedeme obvyklé vyšetření sedimentu, který musíme obarvit některou z doporučených metod.
Dysmorfní erytrocyty mají různé formy, které mohou upozornit na jejich glomerulární původ. Jde o kruhové formy s nepravidelně či difúzně ztluštělými membránami, poměrně patognomonické jsou akantocyty. Jejich zastoupení nad 5 % všech erytrocytů svědčí pro glomerulární původ se senzitivitou 52 % a specifitou 98 % (Schück, 1995).
V detailnějším rozboru (Colombo, 1994) se uvádějí další dysmorfní tvary: ostnaté, deformované nebo konturované stíny erytrocytů, srpkovité nebo osmičkovité formy, centrální defekty apod.
c) nejpřesnější je vyšetření nativního sedimentu mikroskopem s fázovým kontrastem.
d) exaktním, ale náročnějším vyšetřením je imunochemický průkaz Tamm-Horsfallova proteinu na membránách erytrocytů, který se zpravidla provádí s fluorescenčně značenými protilátkami.
Důvody těchto tvarových odchylek erytrocytů jsou většinou uváděny takto: průchod glomerulární membránou, změny osmolality v jednotlivých oddílech nefronu, rozpad a hemolýza erytrocytů během této pasáže. Do úvahy je nutné vzít také další, především hematologická vyšetření svědčící pro hemoragickou diatézu antikoagulační terapii apod. Zcela intaktní erytrocyty glomerulární membránou prakticky neprocházejí (viz Hamburger - doplněk).
Normální i dysmorfní erytrocyty se také mohou vyskytnout na povrchu hyalinních nebo granulovaných válců.
Obecně platí zásada, že nejméně 80% zastoupení dysmorfních erytrocytů, zjištěné nejlépe při vyšetření s fázovým kontrastem svědčí s vysokou specifitou pro glomerulární původ a nejméně 80% isomorfních erytrocytů svědčí pro neglomerulární původ.
Makroskopická hematurie tj. nehodnotitelně vysoký počet erytrocytů v sedimentu se vyskytuje častěji z postrenálních příčin, jako jsou urolitiáza, zánětlivá a nádorová onemocnění vývodných močových cest event. prostaty apod. U renálních příčin jde téměř vždy o nádory, případně polycystické ledviny.
LiteraturaOSN-E
1. Schück, O., Tesař V., Teplan V. a kol.: Klinická nefrologie, Avicenum, 1995
2. Colombo, J.P., Peheim, E.: s. 53 - 85. In: Klinisch-chemische Urindiagnostik. Ed. Colombo J.P., LABORLIFE Verlaggemeinschaft.
3. Urinanalysis with test from Boehringer Mannheim. Firemní tisk.
4. Gambke, B. etal.: Miditron Multicenter Evaluation - Workshop. Klin. Lab. 40, 1994, s. 262-268
5. Masopust, J.: Požadování a hodnocení biochemických vyšetření.I.část. Zdravotnické aktuality 216, Avicenum 1990.
6. Nejedlý, B., Tobiška, J., Zahradníček, L.: Základní a morfologické vyšetření moče. Účelová publikace ministerstva zdravotnictví ČSR 1988
7. Den chemické a morfologické analýzy moče, IVZP a Boehringer Mannheim, 20.3.1993
8. Schumann G.B. etal.: Cytodiagnostic urinanalysis of renal and lower urinary tract disorders. GAKU-SHOIN Medical Publ., N.Y., 1995
9. Ravel R.: Clinical laboratory medicine : Clinical application of laboratory data. Year Book Med.Publish. Inc., 1989. Chapter 12: Urinanalysis. s.153 - 174
Autorské poznámky
poslední revize 10. 9. 1997, Zdeněk Mašek
WIN revize 3. 6. 1999, Gustav Louženský