OSN-SAbstraktOSN-E

Polymerázová řetězová reakce (polymerase chain reaction – PCR) je nejčastěji používanou molekulárně-biologickou amplifikační technikou v diagnostice. Cílová DNA (nebo RNA) bývá často ve vzorcích analyzovaných většinou pro účely genotypizace nebo detekce mikroorganizmů přítomna v tak nízkých koncentracích, že ji není možno po izolaci přímo detekovat. Proto je nezbytné zvýšit analytickou sensitivitu její mnohonásobnou replikací.

 

 

OSN-SSouvisející informaceOSN-E

Molekulárně-biologické techniky

 

OSN-STextOSN-E

 

PCR umožňuje amplifikaci DNA fragmentů až do velikosti 30000 párů bází (bp). Běžně se však používá amplifikace úseků DNA o velikosti jen 200 – 400 bp. Mezi další amplifikační techniky pro DNA patří Q-beta amplifikace, ligázová řetězová reakce (LCR) nebo NASBA (nucleic acid sequence-based amplification).

PCR je in vitro metoda pro enzymatickou syntézu specifických sekvencí DNA. Tyto sekvence jsou definovány tzv. primery, které se hybridizují s komplementárními úseky DNA, která má být amplifikována, pokud takovéto úseky obsahuje. Primery jsou tedy krátké jednořetězcové molekuly DNA (oligonukleotidy), jejichž sekvence je komplementární k jednomu ze dvou řetězců analyzované DNA.

Zvýšením teploty nad 90oC je dvouvláknová DNA reversibilně rozdělena na jednoduché samostatné řetězce (fáze denaturace). Po snížení teploty na cca 50oC se primery přítomné v reakčním mediu vážou na komplementární sekvence denaturované DNA dříve, než stačí DNA renaturovat (fáze přikládání – annealing). Po zvýšení teploty na cca 70oC polymeráza přítomná v reakčním mediu prodlužuje přiložené primery přidáváním nukleotidů, které jsou rovněž přítomny v nadbytku v reakčním mediu v pořadí, které je dáno pořadím komplementárních nukleotidů v denaturované DNA (fáze elongace, extenze). Nakonec je teplota zvýšena opět nad 90oC a je zahájen druhý cyklus amplifikace.  Od druhého cyklu jsou vytvářeny (až na původní dva páry analyzované DNA) úseky DNA o stejné velikosti zakončené primery, které se nazývají amplicony. Poněvadž polymerázy jsou získávány z termofilních bakterií, zůstávají aktivní i po více než 30-40 proběhlých cyklech. Celá reakce se provádí v zařízeních, které se nazývají cyclery. Ty umožňují velmi rychlé změny teploty v reakčních zkumavkách či kapilárách. Jeden cyklus tak trvá obvykle kolem 2 min. Teoreticky se množství ampliconů každým cyklem zdvojnásobuje. V praxi však výtěžnost amplifikační reakce bývá nižší. Přesto při aplikaci cca 30 cyklů získáme zhruba 109-krát více úseků specifikované DNA než bylo v původním materiálu. Poněvadž tyto úseky jsou stejně dlouhé, zjednodušuje se významně možnost jejich detekce. Amplicony mohou být detekovány nejjednodušeji a nejlevněji po jejich elektroforetické separaci v agaróze a vizualizaci pomocí ethidium bromidu pod UV lampou. ELISA techniky za použití vhodných prób (krátké úseky DNA komplementární s částí ampliconu) dovolují sice určitou kvantifikacu ampliconů, jsou však poměrně drahé. V poslední době se začínají stále více uplatňovat metodiky nazvané PCR v reálném čase (RT-PCR), které používají fluoreskující detekční sondy přímo v reakčním mediu a jsou prováděny na přístrojích, které jsou kombinací cycleru a fluorometru. Metodika provádění PCR klade extrémní nároky na dodržování správné laboratorní práce. Amplicony jsou totiž ideální cílové struktury pro primery a kontaminace analyzovaného materiálu amplicony z prostředí laboratoře

způsobuje falešně pozitivní výsledky. Proto při provádění PCR platí zásada oddělených prostorů pro přípravu materiálu k amplifikaci, pro vlastní amplifikaci a detekci ampliconů, přičemž pohyb osob a materiálu musí probíhat jen v uvedením směru . Schéma PCR reakce je uvedeno na obrázku.

 

OSN-SLiteraturaOSN-E

 

1.      Hubert K.: Amplification technics in Thomas L.: Clinical Laboratory Fiagnostics. First Edition, TH-Books Frankfurt/Main, 1998, str. 1449-1452

2.      Lodish H. et al.: Molecular Cell Biology 4.0. Media Connected, W.H.Freeman and Company, New York, 2000, str.246-248

 

OSN-SAutorské poznámkyOSN-E

Ivo Lochman