OSN-SAbstraktOSN-E

Ultracentrifugací se dělí molekuly působením gravitačních sil větších, než jsou síly difuzní. Tato technika je nezbytnou součástí izolace proteinů, nukleových kyselin a buněčných organel,sloužila rovněž jako metoda stanovení molekulových hmotností. Molekulové hmotnosti látek mohou být stanoveny z rychlostí jejich sedimentace v roztoku nebo v gradientu tvořeném inertní látkou s malou molekulovou hmotností (např. sacharosou) nebo v hustotním gradientu vytvořeném rychle difundující látkou (např. CsCl).

OSN-SSouvisející informaceOSN-E

KEY-SultracentrifugaceKEY-E, KEY-ScentrifugaceKEY-E, KEY-Ssedimentační rychlostKEY-E, KEY-Shmotnost částiceKEY-E, KEY-Szónová ultracentrifugaceKEY-E, KEY-Sizopyknická centrifugaceKEY-E

OSN-SText je členěn dle osnovy:OSN-E

Úvod

Sedimentace

Preparativní ultracentrifugace

Použití hustotních gradientů

a. Zónová ultracentrifugace

b. Izopyknická ultracentrifugace

Úvod

Ultracentrifugace je nezbytnou součástí izolace proteinů, nukleových kyselin a buněčných organel. Makromolekulární látky jsou z buněk uvolňovány chemickými nebo mechanickými prostředky. Po rozbití buněk se k odstranění jejich zbytků nebo pro izolaci některých organel používá postupná centrifugace. Při izolaci čistých proteinů se často používá postupného vysrážení řízeného změnou koncentrace soli a pH roztoku.

První ultracentrifuga byla vyvinuta švédským biochemikem Svedbergem (1926 - Nobelova cena za práce na disperzních systémech), dosahovala rychlosti 80000 otáček za minutu.

Sedimentace

Rychlost sedimentace částice závisí na její hmotnosti. Vlivem gravitačního (centrifugačního) pole se rychlost pohybu částic zvyšuje, dokud nejsou na ně působící síly v rovnováze.

Sedimentační rychlost je definována jako dráha molekuly ve směru odstředivého zrychlení za časovou jednotku:

dx/dt = s * w² * x ,

kde:

w - úhlová rychlost,

x - vzdálenost od osy otáčení,

s - sedimentační koeficient, který je látkovou konstantou makromolekuly, hodnoty sedimentačního koeficientu se často uvádí v jednotkách zvaných Svedberg (S), 1 S = 10^-13 s, hodnoty jsou tabelovány s korekcí pro teplotu 20 °C a rozpouštědlo, jehož hustota a viskozita odpovídá čisté vodě.

Hmotnost částice:

m = M/N,

kde:

M - hmotnost 1 molu látky,

N - Avogadrovo číslo (6,023 * 10²³ atomů, molekul nebo částic v jednom molu).

Hmotnost částice může být stanovena při měření jejího sedimentačního koeficientu za předpokladu, že je znám její frikční koeficient. Dříve se centrifugace (analytická centrifugace) používala ke stanovení molekulové hmotnosti makromolekulárních látek, s nástupem jednodušších postupů (gelová filtrace, SDS-PAGE) je centrifugační postup využíván především pro preparativní účely.

Preparativní ultracentrifugace

Preparativní ultracentrifugace postrádá, na rozdíl od analytického postupu ultracentrifugace, zařízení pro pozorování vzorku během odstřeďování. Rotory pro preparativní centrifugaci obsahují otvory pro vložení kyvet se vzorkem umístěné buď rovnoběžně, v určitém úhlu nebo kolmo na osu otáčení rotoru.

Použití hustotních gradientů

V praxi nemusí být zachováván předpoklad, že sedimentace probíhá v homogenním prostředí. Vzorky lze centrifugovat v přítomnosti určité inertní látky (sacharosa, CsCl), jejíž koncentrace a tím i hustota roztoku stoupají směrem ke dnu kyvety.

Toto použití hustotního gradientu napomáhá lepšímu rozdělení jednotlivých složek vzorku.

a) zónová (rychlostní) centrifugace - podle sedimentačních koeficientů,

b) izopyknická (rovnovážná) centrifugace v gradientu hustoty.

a. Zónová ultracentrifugace

Při zónové ultracentifugaci se částice dělí podle svých sedimentačních koeficientů. Roztok směsi makromolekul se opatrně v kyvetě navrství na hustotní gradient, jehož účelem je zamezit konvekčnímu míchání roztoku. Gradient je obvykle tvořen inertním roztokem sacharosy. Během centrifugace se každý druh makromolekul pohybuje gradientem rychlostí převážně závislou na sedimentačním koeficientu, takže se vytvářejí zóny jednotlivých látek, které mohou být navzájem snadno odděleny.

b. Izopyknická centrifugace

Izopyknická centrifugace dělí látky podle jejich hustoty. Při rovnovážné centrifugaci v hustotním gradientu (isos - stejný, pyknos - hustý) je vzorek rozpuštěn v koncentrovaném roztoku nějaké husté a zároveň rychle difundující (s nízkou molekulovou hmotností) látky, jako je např. chlorid nebo síran cesný. Následná centrifugace probíhá až do ustavení rovnováhy v roztoku. Vysoká hodnota centrifugačního pole způsobí, že nízkomolekulární částice v roztoku vytvoří strmý hustotní gradient, ve kterém jednotlivé složky vzorku zaujmou polohu odpovídající jejich hustotě.

Jaroslava Vávrová