OSN-SAbstraktOSN-E

Fluorescence je druh luminiscence, u níž dochází k emisi světla v čase kratším než 10^-8 s. Jedná se o emisi elektromagnetického záření při přechodu mezi dvěma stavy téže multiplicity (obvykle dvěma singlety). Molekuly absorbují světlo při jedné vlnové délce (excitační) a reemitují při větší vlnové délce (emisní).

OSN-SSouvisející informaceOSN-E

Luminometrie

Optické techniky

OSN-STextOSN-E

Text je členěn dle osnovy:

1.Luminiscence

2.Druhy luminiscence

2.- A. Fluorescence

2.- B. Fosforescence

2.- C. Chemiluminiscence

Elektrochemiluminiscence

3.Fluorimetrie

3.- A. Fluorescenční polarizace

3.- B. Vztah koncentrace k intenzitě fluorescenční emise

3.- C. Omezení fluorescenčních měření

3.- C.-1 Vnitřní efekt filtru

3.- C.-2 Efekty pozadí

4.Měření fluorescence - instrumentace

1. Luminiscence

je emise světla při návratu elektronu z excitovaného stavu nebo vyšší energetické hladiny na nižší energetickou úroveň

2. Druhy luminiscence:

- fluorescence

- fosforescence

- chemiluminiscence

vzájemně se liší:

– aktivací elektronu do excitovaného stavu

– způsobem vyzáření energie

· kvantum světelné energie pohlcené molekulou způsobí přemístění elektronu ze základního singletového stavu do jedné z možných excitovaných posic (singletových nebo výše tripletových)

· je-li molekula v excitovaném stavu, je několik cest návratu k původnímu energetickému stavu:
singlet excitovaný ® singlet ustálený (fluorescence 10^-8 s)
triplet excitovaný ® singlet ustálený (fosforescence 10^-4 s - 100 s)

2.- A. Fluorescence

· druh luminiscence, u níž dochází k emisi světla v čase kratším než 10^-8 s

· je emise elektromagnetického záření při přechodu mezi dvěma stavy téže multiplicity (obvykle dvěma singlety)

· molekuly absorbují světlo při jedné vlnové délce (excitační) a reemitují při větší vlnové délce (emisní)

· klasické fluorofory: fluorescein, rhodamin, methylumbelliferon

2.- B. Fosforescence

· emise záření při přechodu mezi dvěma stavy rozdílné multiplicity (triplet - singlet)

2.- C. Chemiluminiscence

· vzniká vyzářením fotonu z molekuly luminoforu po jeho chemické oxidaci

· světlo emitované vzniká oxidační reakcí organických sloučenin (luminol, isoluminol, luciferin) působením oxidantů (H₂O₂ , O₂ , ClO₄^- )

· bioluminiscence: zvláštní forma chemiluminiscence - např. enzymy luciferáza, alkalická fosfatáza zvyšují efekt luminiscenční reakce

Elektrochemiluminiscence

· je modifikace chemiluminiscence, kdy světlo je generováno sérií chemických reakcí iniciovaných elektrochemicky:

- na elektrodě je dvojmocná sůl ruthenia oxidována na trojmocnou, zároveň je tripropylamin (TPA⁺) oxidován na radikál TPA⁺ , tento radikál má redukční vlastnosti, proto snadno redukuje trojmocný rutheniový komplex na dvojmocný, velký rozdíl potenciálů způsobí, že elektron z TPA přeskočí do vyšší energetické hladiny rutheniového kationtu, přechodem tohoto elektronu do základního stavu se vyzáří foton (luminiscence) a rutheniový komplex je opět schopen další oxidace

· rutheniový kation prochází reakcí cyklicky, nespotřebovává se, chová se jako enzym

· TPA se rozpadá na dipropylamin, je v reakci spotřebováván, slouží jako substrát

3. Fluorimetrie

3.- A. Fluorescenční polarizace

· světlo je tvořeno elektrickými a magnetickými vlnami vzájemně kolmými

· polarizované světelné vlny mají vektory elektrického pole orientovány v jedné rovině

· využívá se změn fluorescenční polarizace např. v průběhu imunologických reakcí, aplikovatelná na homogenní reakce nízkomolekulárních analytů (např. léky)

Fluorimetrie - polarizační analyzátor · vzorek je excitován polarizovaným světlem (získá se max. citlivost), analyzátor polarizovaného světla je nastaven k měření intenzity emitované fluorescence světla ve vertikální ploše, pak se polarizační analyzátor otočí o 90^o a měří se emitované záření v horizontální rovině

3.- B. Vztah koncentrace k intenzitě fluorescenční emise

· intenzita fluorescence je úměrná koncentraci fluoroforu a excitační intenzitě

· vztah platí pro zředěné roztoky, kde je absorbance < 2 % excitovaného záření

· při absorbanci > 2 % je závislost nelineární, je způsobena tzv. “vnitřním filtrovým efektem”

· další faktory ovlivňující měření intenzity fluorescence:

a) citlivost detektoru

b) stupeň rozptylu světla před detekcí (ztráty, pozadí)

3.- C. Omezení fluorescenčních měření

Fluorescenční měření

· řádově citlivější než měření absorbance (100 - 1000´),

· absorbance v roztoku je určena koncentrací a dráhou světla,

· fluorescence je určena koncentrací, dráhou světla a intenzitou světelného zdroje

Omezení fluorescenčních měření:

· koncentrační efekty (vnitřní filtrový efekt, koncentrační zhášení)

· efekty pozadí (Rayleighův rozptyl, Ramanův rozptyl)

· vliv rozpouštědel ( interferující nespecif. fluorescence a zhášení z rozpouštědla)

· vzorkové efekty (zhášení světla, interferující fluorescence, adsorpce)

· teplotní efekty

· fotodekompozice vzorku

3.- C.- 1. Vnitřní (skrytý) efekt filtru

Je-li absorbance roztoku > 2 % excitovaného světla, pak může mít fluorescence nelineární průběh, v extrémním případě může být intenzita fluorescenční emise z velmi koncentrovaných roztoků menší než emitovaná intenzita zředěných roztoků téhož fluoroforu.

Vnitřní filtrový efekt - excitované světlo je absorbováno samotným fluoroforem.

Eliminace:

• měření velmi zředěných roztoků
• snímání signálu mimo střed kyvety

Koncentrační zhášení

Makromolekula (protilátka) značená fluoroforem - při excitaci může být fluorescenční značení prostorově uzavřeno, proto dojde ke sníženému přenosu budící energie (problém průtokové cytometrie, LIF).

3.- C.- 2. Efekty pozadí

Světlo je absorbováno molekulami při všech vlnových délkách a emitováno bez ztráty energie
(změna vibrační energie, zachováni energetických hladin)

Rayleighův rozptyl - nemění se vlnová délka

· použití dobře definovaných excitačních a emisních interferenčních filtrů

· použití polarizátorů

Ramanův rozptyl - změna vlnové délky

Následkem nepružných kolizí se energie mění (př. při excitaci se energie sníží, rozptyl světla probíhá při větší vlnové délce)

· ovlivnění optikou ( za cenu snížení citlivosti)

· volba vlnových délek (l_em, l_ex) mimo oblast vzniku rozptylu

4. Měření fluorescence - instrumentace

Základní části fluorimetru:

· xenonový zdroj

· zdroj napětí

· monochromátor excitačního záření

· kyveta (průtoková cela) se vzorkem

· monochromátor emitovaného záření

· detektory

· zesilovače

· malá část paprsku (10%) je srovnávací (přes fotonásobič)

· emisní optika je vždy kolmá na excitační

· používá se pro koncentrační měření předem definovaných podmínek (fixní vlnová délka excitačního záření, fixní vlnová délka emitovaného záření)

Excitační zdroj (abs.spektra fluoreskujících látek - 300 - 550 nm)

· xenonová lampa zajišťující kontinuum energie pro 250-800 nm, záblesková - 2500 pulsů/sec., 200-1100 nm

· křemenná halogenová lampa

· rtuťová lampa

· laserový zdroj

Monochromátory

· interferenční filtry (většinou)

· barevné skleněné filtry

· mřížky (spektrofluorimetr)

· hranoly

Vzorková cela

· pravoúhlé umístění vzorku v geometrii přístroje (paprsek emitovaného záření se snímá kolmo na paprsek excitačního záření) minimalizuje vliv pozadí · materiál - hlavně křemen

Detektory

fotonásobiče

Automatizované fluoro- a spektrofluorometry

· imunoanalyzátory

· fluorescenční polarizované systémy (TD_x , IM_x , Stratus)

· časově rozlišující (DELFIA - imunoreagencie značeny europiem)

Fluorometry pro speciální aplikace

· hematofluorometry

· laserem indukovaná fluorimetrie

· průtoková cytometrie

OSN-SAutorské poznámkyOSN-E

Jaroslava Vávrová