OSN-SAbstraktOSN-E

Průtoková cytometrie je metoda, která umožňuje simultánní měření a analýzu fyzikálně-chemických vlastností buňky nebo jiných biologických částic během jejich průchodu laserovým paprskem.

OSN-SSouvisející informaceOSN-E

OSN-STextOSN-E

Průtoková cytometrie je metoda, která umožňuje simultánní měření a analýzu fyzikálních-chemických vlastností buňky nebo jiných biologických částic během jejich průchodu laserovým paprskem. Ve chvíli, kdy buňka tento paprsek kříží dochází k lomu a rozptylu světla, který podle směru a úhlu lomu bývá označován jako přímý rozptyl - forward scatter (FSC) a boční rozptyl - side scatter (SSC). FSC je charakterizován lomem světla o malém úhlu ( 2^o-13^o ) a je úměrný velikosti buňky. Úhel bočního rozptylu (SSC) je 90⁰ a je indikátorem vnitřní buněčné struktury resp. granularity. Kromě parametrů lomu a rozptylu světla je detekována rovněž fluorescence procházejících buněk nebo částic. Fluorescenční barviva (fluorochromy) navázané na analyzované buňky nebo částice absorbují světlo určité vlnové délky vyzařované laserem a následně vyzařují (emitují) část takto absorbovaného světla avšak již o odlišné vlnové délce. V průtokové cytometrii se používají fluorochromy, které mají většinou stejné spektrum absorpční, ale jiné emisní. Průtokové cytometry využívají jako světelného zdroje totiž nejčastěji argonový laser o excitační vlnové délce 488 nm.

Vlastní analytická zařízení se nazývají průtokové cytometry a skládají se ze systému fluidního, optického a elektronického. Pomocí fluidního systému jsou buňky obaleny pláštěm nosné tekutiny (PBS, komerční tekutiny jako FACSFlow, Bioton, Unisol) a pod tlakem hnány do speciálního prostoru (flow chamber), kde dochází ke křížení dráhy paprsku monochromatického laseru procházejícího buňkou .

Optický systém sestává z části excitační tvořené laserem a soustavou čoček a hranolů usměrňujících světelný paprsek a části sběrné. Sběrná část optiky se sestává z optických zrcadel a filtrů umožňujících detekci světelných kvant specifické vlnové délky příslušnými optickými detektory.

Systém elektronický pak převádí optický signál na elektrický a zároveň jej digitalizuje pro počítačovou analýzu. Data všech parametrů měřených na individuální buňce jsou shromážděna a uchována jako datový soubor, tzv. “list mode file”, který je připraven k následné analýze. Zobrazení dat může být provedeno mnoha způsoby, nejčastější je tzv. “dot plot”, což je dvourozměrný graf, ve kterém je každá buňka zobrazena jako tečka. Výsledná data mohou být rovněž zobrazena v trojrozměrném izometrickém grafu nebo ve formě histogramu pro každý jednotlivý parametr. Výrazným přínosem této technologie je multiparametrická analýza, která umožní výběr různých buněčných populací s různými vlastnostmi a jejich vzájemnou kombinaci.

Průtokové cytometry jsou běžně vybaveny dvěma až třemi detektory, které měří světlo specifické vlnové délky emitované buňkou. Nejčastějšími fluorochromy užívanými v průtokové cytometrii se společnou excitační vlnovou délkou 488 nm jsou fluorescein izothiokyanát (FITC), který emituje při 530 nm , phycoerytrin (PE) s emisí při 530 nm , peridin-chlorophyl (PerCP) s emisí při 675 nm, Phycoerythrin-Cy5 (PE-Cy5) s emisí při 667 nm nebo Texas red s emisí při 615 nm. Většina těchto fluorochromů bývá konjugována s různými protilátkami a užívána současně pro vícebarevnou analýzu.

V současné době začíná počet fluorochromů a tudíž i parametrů v multiparametrové analýze výrazně stoupat, což vyžaduje přítomnost druhého event. dalších světelných zdrojů odlišné excitační vlnové délky. Jako druhý laser je využíván především helium-neonový laser nebo laser-dioda o vlnové délce 663 nm. Z fluorochromů užívaných pro tyto aplikace můžeme zmínit např. Allophycocyanin (APC) s emisí při 660 nm, APC-Cy5 s emisí při 767 nm a iododicarboxycyanin (Cy5) s emisí při 667 nm. Přístroje vybavené dalším světelným zdrojem umožňují čtyř, pěti a vícenásobnou barevnou analýzu a slouží zejména k identifikaci unikátních buněčných populací nebo simultánní  detekci většího počtu buněčných znaků resp. charakteristik.

Pro správné nastavení neboli kalibraci přístroje se užívá speciálních mikrokuliček nesoucích na svém povrchu různé fluorochromy. Během procesu kalibrace dochází jednak k optimalizaci signálu parametrů lomu a rozptylu světla a jednak kompenzaci jednotlivých fluorochromů. Řada fluorochromů užívaných v průtokové cytometrii se totiž ve svých emisních spektrech do určité míry překrývá. Pomocí speciálního nastavení optických filtrů lze a je zapotřebí vzájemný překryv těchto signálů výrazně eliminovat.

Speciální aplikací průtokové cytometrie je buněčné třídění (cell sorting). Jedná se o kombinaci analytických postupů průtokové cytometrie se schopností třídit buňky na základě předem známých parametrů. Během procesu třídění jsou buňky emitující žádaný fluorecenční signál elektricky nabity ve vysokonapěťovém elektrickém poli mezi speciálními tzv. vychylovacími destičkami a poté tříděny do sběrných zkumavek.

Schéma fluidní části průtokového cytometru Schéma optické části průtokového cytometru

OSN-SLiteraturaOSN-E

1. Ormerod M.G.: Flow Cytometry. Second Edition, IRL Press, Oxford, New York, Tokyo, 1994
2. Shapiro H.M.: Practical Flow Cytometry, Third Edition, Willey-Liss, New York-Chichester-.Brisbane-Toronto-Singapore, 1995

OSN-SAutorské poznámkyOSN-E