AbstraktOSN-E
Mikrolymfocytotoxický test (CTT) je základní serologická
metoda pro testování histokompatibility. Je používána pro typizaci HLA antigenů
(lidské leukocytární antigeny, z angl. human leucocyte antigen), dále pro
určení HLA typu nebo pro průkaz a stanovení specificity HLA protilátek
v séru.
Související
informace
TextOSN-E
Mikrolymfocytotoxický test (CTT) je základní serologická
metoda pro testování histokompatibility používaná pro typizaci HLA antigenů
(dále: určení HLA typu) nebo pro průkaz a stanovení specificity HLA protilátek
v séru. Určení HLA typu je nezbytné pro výběr nejvhodnějšího páru
dárce-příjemce před transplantací orgánů nebo krvetvorných buněk, dále pro
studium asociací HLA antigenů s některými nemocemi (např. m. Bechtěrev) a
může se uplatnit i při řešení paternitních sporů. Vyšetření HLA protilátek je
prováděno pravidelně u pacientů před transplantací ledvin, při sledování
potransfúzních reakcí a dále je využíváno pro vyhledávání HLA typizačních sér.
Stanovení donor-specifických HLA protilátek mikrolymfocytotoxickým testem je
jednou z variant provedení křížové zkoušky před transplantací orgánů nebo
kostní dřeně.
Principem mikrolymfocytotoxického testu je reakce mezi HLA
antigenem na povrchu buňky a sérem se
specifickou HLA protilátkou. V případě, že buňky nesou právě ten HLA antigen
proti němuž je HLA protilátka přítomná v séru namířena, pak v průběhu
1. inkubační doby dojde na povrchu buňky k vytvoření komplexu
antigen-protilátka. Po přidání králičího komplementu (2. inkubační doba)
dochází k aktivaci komplementu komplexem antigen-protilátka, aktivovaný
komplement rozruší buněčnou membránu a dochází k lýze buňky. Pokud se v séru nenachází HLA
protilátka specifická pro daný HLA antigen, pak k tvorbě komplexu
antigen-protilátka nedochází,není možná ani aktivace komplementu a buňky
zůstávají živé. Po obarvení buněčné suspenze vitálním barvivem (eosin Y,
trypanová modř) a odečtení pod mikroskopem je reakce, ve které jsou buňky
poškozeny a obarveny vitálním barvivem hodnocena jako pozitivní, reakce, kde
buňky zůstávají živé a nezabarveny, je hodnocena jako negativní.
Mikrolymfocytotoxický test lze použít pro:
1.
Určení HLA
typu – buňky
s neznámými HLA antigeny jsou inkubovány spolu se séry s předem určenou specificitou HLA
protilátky.
2.
Určení HLA protilátky a její specificity – sérum je
testováno proti panelu buněk se známým HLA typem
Základní komponenty nutné pro provedení
mikrolymfocytotoxického testu:
A.
Buňky
Pro určení HLA typu, vyšetření HLA protilátek v séru a
pro křížovou zkoušku nejčastěji používáme lymfocyty izolované z nesrážlivé
periferní krve na hustotním gradientu Ficoll-Hypaque;
v případě testování buněk od zemřelého dárce orgánů lze využít i lymfocyty
izolované z lymfatické uzliny nebo sleziny.
Pro typizaci HLA antigenů I.třídy lze použít buď
neseparované lymfocyty periferní krve (přibližně 80 % T lymfocytů a 10-15 % B lymfocytů) nebo T lymfocyty
izolované pomocí Class I beads (paramagnetické kuličky potažené
monoklonální protilátkou proti CD8), pro typizaci HLA antigenů II.třídy je
nutno použít suspenzi B lymfocytů izolovaných pomocí Class II beads (s monoklonální protilátkou proti
monomorfnímu epitopu β-řetězce HLA molekuly II.třídy).
B.
Typizační séra se specifickou HLA protilátkou
Jednotlivá antiséra proti HLA antigenům jsou předem
rozpipetována v jamkách mikrotitrační destičky (jejich pozice je
zaznamenána v odečítacím protokolu), nesmí chybět pozitivní kontrola –
polyvalentní sérum reagující se všemi typy HLA antigenů (současně i kontrola
aktivity komplementu) a negativní kontrola – sérum neobsahující HLA protilátky
(kontrola životnosti buněk). Pro kompletní typizaci HLA antigenů I. a II.třídy
se používá 200 – 300 typizačních sér.
Zdrojem typizačních sér jsou především gravidní ženy
(senzibilizované v průběhu těhotenství
HLA antigeny otce exprimovanými na buňkách vyvíjejícího se plodu) nebo
pacienti po transplantacích, popř. transfúzích (senzibilizovaní
inkompatibilními HLA antigeny). Proti některým HLA antigenům lze vyrobit i
monoklonální protilátku.
C.
Komplement
Jedná se o pool králičích sér připravený minimálně z 50
jedinců.
D.
Barvivo
Z vitálních barviv je nejčastěji používán eosin Y,
popř. trypanová modř (živé buňky – jasné a světlolomné, mrtvé buňky – tmavé a
zduřelé), u fluorochromatické metody je používána dvojice fluorochromů
ethidiumbromid- akridinová oranž (živé buňky – zelené, mrtvé buňky- červené).
Reakce v každé jamce mikrotitrační destičky je
v inverzním světelném mikroskopu (popř. fluorescenčním mikroskopu)
hodnocena pomocí číselného mezinárodního skórovacího systému – jednotlivými
čísly je hodnoceno % mrtvých buněk v zorném poli.
Procento Skóre Interpretace
0 - 10 % 1 negativní
11- 20 % 2 pravděpodobně
negativní
21- 50 % 4 slabě
pozitivní
51- 80 % 6 pozitivní
81- 100% 8 silně pozitivní
Antigeny HLA se vyhodnotí na
základě pozitivních reakcí s jednotlivými séry o známých specificitách,
specificita HLA protilátky se určí podle pozitivních reakcí s jednotlivými buňkami se známým HLA typem.
LiteraturaOSN-E
1.
Stites
D.P., Terr A.I. : Základní a klinická imunologie, Victoria Publishing, Praha
1994
2.
Dyer
P., Middleton D.: Histocompatibility Testing: A Practical Approach, IRL Press,
Oxford, New York, Tokyo, 1993
Autorské
poznámky
Schváleno 1.7.2002 ČLS
- Společnost alergologie a klinické imunologie, sekce laboratorní imunologie.OSN-E