Abstrakt
Imunofluorescenční mikroskopie je imunohistochemická technika na detekci a lokalizaci antigenů po jejich reakci s protilátkami označenými fluorescenčními látkami. Fluoreskující imunokomplexy v tkáních nebo na buňkách je možné pozorovat ve fluorescenčním mikroskopu.
Související informace
Text
Imunofluorescenční mikroskopie je používána nejen k přímé detekci antigenů eventuelně protilátek navázaných na tyto antigeny ve tkáňových řezech, buněčných kulturách či nátěrech suspenze mikroorganismů (metody přímé imunofluorescence), ale také k průkazu protilátek přítomných v analyzovaných vzorcích proti antigenům substrátu fixovaného na vhodnou matrici, nejčastěji na podložní sklíčka (metody nepřímé imunofluorescence). V tomto případě je vizualizace analyzovaných protilátek ve vzorcích provedena teprve další inkubací se sekundárními protilátkami značenými fluorochromy. Metody nepřímé imunofluorescence využívající k diagnostice autoprotilátek tkáňové řezy a buněčné kultury jsou považovány a doporučovány za základní screeningové techniky v laboratorní diagnostice autoprotilátek, přestože jejich standardizace je principiálně obtížná. Nelze totiž vyloučit subjektivní faktor hodnotitele zpracovaných preparátů.. Podobně je tomu s využitím těchto technik v oblasti infekční sérologie. Techniky využívající tkáňové řezy a fixované buněčné kultury jsou výhodné pro průkaz, méně vhodné pro stanovení (určení koncentrace) příslušné protilátky. Nejčastěji používanou fluorescenční látkou pro označování detekčních sond je fluoresceinizothyokyanát (FITC). V posledních letech se stávají pro některé protilátky nebo skupiny protilátek dostupné diagnostické soupravy, které používají místo FITC-značených konjugátů konjugáty značené enzymy. Vyhodnocování preparátů zpracovaných takovými technikami sice nevyžaduje fluorescenční mikroskop, prodlužuje však celou metodiku o jeden krok (inkubace se substrátem) a v rutinní diagnostice zatím nejsou s těmito modifikacemi velké zkušenosti.
Technické předpoklady a metodické poznámky pro provádění IF technik
- IF se provádí většinou ve variantě s dopadajícím světlem. Fluorescenční mikroskop musí být vybaven „suchými“ objektivy deklarovanými výrobcem pro IF techniky se zvětšením 20x a 40x. Pro lepší orientaci ve tkáňových řezech je dobré mít k dispozici i objektiv se zvětšením 10x a pro lepší identifikaci subbuněčných struktur i objektiv zvětšující 60x. Předpokládá se používání okuláru o zvětšení 10x, takže dostupné zvětšení by mělo být orientačně v rozmezí 100-400x, resp. 600x. Je třeba si uvědomit, že při používání imunofluorescenčních technik v dopadajícím světle platí, že čím menší je zvětšení objektivu, tím nižší intenzitu fluorescence můžeme pozorovat.
- Prakticky jednotně je používán ke značení sekundárních protilátek využívaných v IF technikách pro detekci protilátek fluoresceinisothiokyanát (FITC), takže mikroskop musí být opatřen vhodnými excitačními a bariérovými filtry pro tento fluorochrom. Mnozí výrobci pro speciální účely, které však v rutinní diagnostice protilátek zatím nejsou využívány, nabízejí filtry a jejich kombinace s velmi úzkými spektrálními pásy. To může způsobit omezení výtěžnosti získané fluorescence a v konečném důsledku snížení citlivosti metody.
- Intenzitu získané fluorescence ovlivňuje podstatně i zdroj světla. Většina fluorescenčních mikroskopů používá jako zdroj světla 100W rtuťovou výbojku. Je nutno pamatovat na to, že její životnost bývá 150-200 hodin (mělo by být udáno výrobcem) a že tyto výbojky nelze používat po době jejich životnosti (i když ještě svítí) neboť se velmi mění jejich světelné charakteristiky. Ve většině případů lze použít, pokud je to výrobcem mikroskopu doporučeno, i ekonomicky výhodné 50W halogenové výbojky (životnost až 2000 hodin), u nichž však bývá výtěžnost fluorescence nižší.
- Aby bylo možno mezilaboratorně a kontinuálně IF diagnostiku standardizovat a srovnávat nálezy mezi jednotlivými laboratořemi a během určitých období je nezbytné, aby pro každý objektiv byla pro každou sérii odečítaných preparátů provedena kalibrace mikroskopu za použití kalibračních částic značených FITC nebo, jak je tomu např. v infekční sérologii a v dg autoprotilátek, za použití séra o známém titru protilátek. Pro běžnou denní kontrolu si pak laboratoř může na základě komerčně dodávaných a mezinárodně deklarovaných sér připravit vlastní kontroly/kalibrátory. Tyto vlastní kontroly pak mohou být uchovávány v malých podílech zmražené při -70oC a po rozmražení použity jen jednou, nebo stabilizované 0,01% azidem sodným a 0,03% kyselinou ε-aminokapronovou při teplotě 2-8oC po dobu několik měsíců. I když je zřejmé, že při hodnocení není možné nikdy odstranit subjektivní faktor, je vhodné, bude-li se intenzita fluorescence a tím i pozitivita preparátu hodnotit v těchto kategoriích:
|
negativní |
není pozorována žádná fluorescence očekávaných struktur v preparátu |
|
hraniční |
nezřetelná, ale patrná fluorescence očekávaných struktur |
|
slabě pozitivní |
zřetelná, ale slabá fluorescence očekávaných struktur |
|
pozitivní |
zřetelná, jasná fluorescence očekávaných struktur |
|
silně pozitivní |
velmi silná fluorescence, která může někdy způsobovat i splývání očekávaných struktur (např. zrnění) |
Pro lepší orientaci v preparátech je možné preparáty dobarvovat Evansovou modří, která bývá přidávána do roztoku konjugátu nebo se přidává do promývacího roztoku pro odmývání nenavázaného konjugátu před „zamontováním“ preparátu.
Montovací roztoky, které jsou většinou založeny na glycerinové bázi, by měly obsahovat anti-zhášecí substance, které dovolují preparáty v jednom zorném poli déle pozorovat a usnadňují fotografování preparátů. Montovacího roztoku by mělo být aplikováno na preparát vždy jen nejmenší nezbytné množství, poněvadž jeho nadbytek jednak znepříjemňuje mikroskopování tím, že vytékající montovací roztok špiní podložní stolek mikroskopu, ale také může zvyšovat nespecifické pozadí preparátu.
Chceme-li dosáhnou ve fluorescenčním mikroskopu kvalitního obrazu, musíme věnovat velkou pozornost výběru objektivu. Objektiv by měl mít:
- minimální autofluorescenci (UV excitace), to zajišťují objektivy vyrobené ze speciálních optických materiálů, jako byl dříve fluorit dnes nahrazený syntetickými křemennými skly
- maximální intenzitu (I) obrazu, kterou lze vypočítat ze vztahu
I = k * (NA)4/M2 , kde
NA je numerická apertura objektivu
M je celkové zvětšení (objektiv x oklulár)
k je konstanta
Ze vztahu je zřejmé, že k dosažení maximální intenzity fluorescenčního obrazu je třeba použít objektiv s co největší numerickou aperturou a co nejmenším zvětšením. Požadavek maximální intenzity fluorescence a maximálního zvětšení jdou tedy proti sobě, a tak je nutno v praxi volit kompromis.
Pro ilustraci pak lze uvést příklad pro nejčastěji používané objektivy zvětšující 40x, které mohou mít danou NA:
U-PlanFluorit (NA = 0,75) I = 0,3
U-PlanApo (NA = 0,85) I = 0,5
U-PlanApo im (NA = 1,00) I = 1,0
Imerzní objektivy mají vyšší NA při stejném zvětšení, a proto by jim měla být dávána přednost, ale práce s nimi je méně pohodlná než s objektivy pracujícími bez imerze. Mezi imerzními objektivy jsou z pracovního hlediska zase preferovány objektivy “vodní”, ale ty jsou zase relativně velmi drahé.
Aby se zvýšila výtěžnost fluorescence po osvícení preparátu (důležité např. pro pořízení dokumentace preprátu fotografováním či snímáním kamerou), přidávají se do montovacího roztoku látky, které tuto výtěžnost zvyšují. Mezi ně patří např. DABCO (1,4-diazobicyklo [2,2,2]-octane, Aldrich), který se přidává do montovacího media (70% glycerol v PBS pH 8,3) v poměru 1 g na 100 ml společně s 2,5 g NaN3 a pH upraví konc. HCl na hodnotu 8,3. Preparáty je nutné před montováním velmi dobře promýt, aby se zabránilo nespecifickému zvýšení fluorescence pozadí.
Autorské poznámky
Ivo Lochman