Abstrakt
Imunoturbidimetrická analýza je založena na měření
množství imunitních komplexů vytvořených interakcí specifických protilátek
s antigenem - analytem.
Související informace
Text
Smísí-li se rozpustný antigen ve vhodném poměru
s odpovídající protilátkou, vytvoří se precipitát. Kvantitativně byla tato
reakce popsána již v r. 1929 Heidelbergem a Kendallem. Precipitační křivka
je znázorněna na obr. 1.
Obr. 1: Precipitační křivka podle Heidelbergera a
Kendalla
Ab Excees zone – oblast nadbytku protilátky
Equivalence zone – oblast ekvivalence antigenu a
protilátky
Ag Excess zone – oblast nadbytku antigenu
V oblasti nadbytku protilátky vzrůstá množství
precipitátu s přídavkem antigenu. V oblasti ekvivalence je množství
precipitátu největší a v oblasti nadbytku antigenu se tvoří jen malé
imunokomplexy, které neprecipitují. Z analytického hlediska můžeme
precipitační křivku rozdělit na oblast využitelnou pro měření, bezpečnostní
oblast a na oblast za kritickým bodem. Tento kritický bod, který představuje
nejvyšší koncentraci antigenu, který může analyzovaný vzorek obsahovat, aniž
bychom naměřili falešně nízké koncentrace antigenu, by měl být znám u každé
prováděné techniky v daném analytickém systému (obr.2).
K měření množství vytvořených imunitních komplexů je
možno použít turbidimetrie, která je založena na skutečnosti, že po průchodu
světelného paprsku suspensí imunitních
komplexů dochází k poklesu jeho intensity v důsledku roztylu,
absoprce a odrazu. Matematický popis zákalu (turbidity) - T - lze vyjádřit
rovnicí:
T= (1/b).ln(Io/I),
kde b je tlouštka kyvety, Io počáteční
intensita světelného paprsku, I intensita paprsku po průchodu suspensí částic
(imunitních komplexů). Pokles intensity
paprsku je úměrný množství imunitních
komplexů v roztoku. Rychlost tvorby imunitních komplexů je zvýšena
přítomností ve vodě rozpustných lineárních polymerů (např. polyethylenglykol
6000), které vedle zvýšení rychlosti interakce specifických protilátek
s analytem a také suspensi imunitních komplexů v roztoku stabilizují.
Při konstantní vysoké koncentraci specifických protilátek, je množství vytvořených imunitních komplexů
(turbidita analyzovaného vzorku tělní tekutiny) přímo úměrné koncentraci
analytu. Pracovní koncentrační rozmezí,
pro které platí tato závislost je ohraničené nejvyšší koncentrací
kalibrátoru, vzorky obsahující vyšší
koncetrace analytu je třeba retestovat po vhodném naředění (viz výše, obr.2).
Kromě turbidimetrie, kde
měříme zeslabení intenzity paprsku procházejícího světla zakaleným vzorkem, je
možno měřit velikost zákalu způsobeného imunokomplexy i pomocí nefelometrie,
kde je měřeno světlo rozptýlené na precipitátu. Úhel rozptylu je dán velikostí
částic a vlnovou délkou dopadajícího světla. Princip turbidimetrie a
nefelometrie je znázorněn na obr. 3.
Obr.2: Křivky závislosti signálu na koncentraci
antigenu a protilátky
1 – nízká, 2 – střední, 3 – vysoká koncentrace
protilátky
a: vstupující světlo, b:
štěrbina, c: reakční kyveta, d: fotodetektory, e: zařízení pro pohlcení světla
Literatura
Autorské poznámky
Laďka Rozprimová