Abstrakt
Metoda otisků
(z angl. blotting) je analytická metoda, která umožňuje přenos molekul
z mobilní fáze (např. agarózový nebo polyakrylamidový gel, ale také běžný
roztok) do pevné fáze, na kterou jsou fixovány. Na povrchu
této pevné fáze jsou tyto antigeny detekovány
specifickými protilátkami.
Související
informace
Text
Metoda otisků (z angl. blotting) je analytická
metoda, která umožňuje přenos molekul z mobilní fáze (např. agarózový nebo
polyakrylamidový gel, ale také běžný roztok) do pevné fáze, na kterou jsou
fixovány. Tuto pevnou fázi může představovat např. nitrocelulózá membrána.
Přenos se může uskutečnit běžnou difúzí přiložením membrány na gel, což
připomíná odsávání skvrn pomocí savého papíru a odtud také název blotting,
pomocí jednosměrného proudu (electroblotting) nebo filtrací
roztoku přes membránu (dot blotting) pomocí speciálních zařízení.
Molekuly přenesené a fixované na pevné fázi se zviditelňují přímo po fixaci
různými barevnými reakcemi nebo autoradiografií nebo až po reakci se
specifickými protilátkami (immunoblotting).
Otiskové metody se používají především pro
přenos molekul DNA, RNA, proteinů a glykoproteinů po jejich předcházející
separaci elektroforézou nebo izoelektrickou fokusací na gelových nosičích a umožňují
tak průkaz několika specifických antigenů v jednom vzorku najednou
(jakousi fenotypizaci vzorku a tím i jedince, od kterého byl získán). Na druhé
straně nacházejí stále více uplatnění imunodotovací techniky (DIBA – dot immunobindig assay),
kdy jsou na membránách imobilizovány čisté antigeny, které pak mohou sloužit ke
screeningovému průkazu protilátek v analyzovaných vzorcích. Tyto techniky
našly uplatnění např. v diagnostice spec. IgE, autoprotilátek, infekční
sérologii apod. Na membrány mohou však být navázány také specifické protilátky,
které pak slouží naopak k průkazu antigenů v analyzovaných vzorcích.
Výhodou těchto technik je jejich jednoduchost, dobrá reprodukovatelnost, malá
spotřeba vzorku a poměrně vysoká citlivost. Např. dolní hranice stanovitelnosti
imunoglobulinů pomocí těchto technik je
1-5 ng. Význam DIBA vzrůstá v poslední době také s rozvojem
techniky biočipů, která umožňuje současnou detekci a semikvantifikaci desítek
analytů v mikrolitrových objemech jednoho vzorku.
Přenos fragmentů DNA z agarózového gelu na
nitrocelulózovou membránu popsal poprvé roku 1975 E.M.Southern. Odtud dostala
tato technika název southern blotting. V r. 1977 tuto metodu
vylepšili použitím diazobenzylmethylovaného papíru J.C.Alvine a kol. Tato
varianta dostala název northern blotting. R. 1979 J. Renart a
kol. a H. Towbin a kol. obě metody adaptovali na analýzu proteinů
(immunoblotting). R. 1981 W.N.Burnette použil na detekci imunobilzovaných
antigenů specifické protilátky a radioaktivně značený protein A ve funkci
druhého ligandu. Tato metoda dostala název western blotting,
přestože jako předchozí varianty nemá se zeměpisnými stranami co do činění.
Otiskové metody mají tyto kroky:
1.
Zkoumaná
směs antigenů se rozdělí pomocí jednorozměrné nebo dvourozměrné elektroforézy
nebo izoelektrickou fokusací na agarózovém nebo polyakrylamidovém gelu nebo se
purifikované antigeny nebo protilátky naředí na vhodnou koncentraci ve vhodném
pufru.
2.
Pomocí
vhodné blotovací aparatury se přenesou antigeny z gelu na vhodnou membránu
(matrici).
3.
Po
imobilizací antigenů na membránu se membrána opracuje blokujícím agens, čímž se
vysytí (zablokují) nespecifická vazebná místa, aby v následných krocích
nedocházelo k nespecifickým interakcím mezi detekční sondou a matricí.
Detekčními sondami mohou být protilátky, specifické vazebné proteiny nebo jiné
ligandy. Při nespecifické vazbě detekčních sond s matricí vzniká silné
pozadí, které znesnadňuje nebo dokonce znemožňuje vyhodnocení analýzy.
V případě imobilizace DNA nebo RNA může být provedena před vlastní detekcí
amplifikace specifických úseků těchto nukleových kyselin pomocí polymerázové
řetězové reakce (PCR – polymerase chain reaction). V případě imobilizace
RNA musí být samozřejmě provedena nejprve reversní transkripce RNA na cDNA.
Tato PCR in situ výrazně zvyšuje citlivost metody.
4.
Posledním
krokem je vizualizace použitím detekční sondy (např. autoradiograficky,
barevnou reakcí, fluorescenčně apod.), která může mít také několik kroků.
Literatura
1.
Ferenčík
M.: Imunochémia, Alfa, Bratislava, 1989, str. 404 – 410
Autorské
poznámky
Ivo
Lochman