OSN-SAbstraktOSN-E

MLC test (MLCELL) patří k funkčním buněčným testům. Měří odpovídavost T lymfocytů na stimulační determinanty asociované s HLA molekulami II.třídy (HLA-DR, -DQ nebo –DP). MLC test se používá k zjišťování histokompatibility mezi dárcem a příjemcem před transplantací orgánů nebo krvetvorných buněk. V souvislosti se zaváděním metod molekulárně-genetické typizace na vysoké úrovni rozlišení se však význam použití MLC testu k zjištění inkompatibility snižuje. V současnosti se MLC test diagnosticky používá především k zjištění imunokompetence T lymfocytů u imunodeficitních stavů.

OSN-STextOSN-E

MLC test (test směsných lymfocytárních kultur, z angl. mixed lymphocyte culture - MLCELL) je funkční buněčný test, který měří odpověď T lymfocytů na stimulační determinanty asociované s HLA molekulami II.třídy (HLA-DR, -DQ, popř. –DP). Kultivujeme-li společně lymfocyty dvou jedinců s rozdílnými HLA antigeny II.třídy, jejich T lymfocyty odpovídají na rozdíly v HLA molekulách populace stimulujících buněk - exprimovaných především na B lymfocytech a monocytech - buněčnou proliferací a syntézou nové DNA. Reaktivita v MLC je tak in vitro modelem in vivo probíhající imunitní odpovědi na alogenní podnět – rozdílný HLA antigen II.třídy. Tento test je v praxi používán pro výběr nejvhodnějšího (tj. nejméně stimulujícího) dárce v rámci příbuzenských transplantací ledvin a k výběru optimálního nepříbuzného dárce kostní dřeně – u HLA identického páru odhaluje skryté inkompatibility v HLA antigenech II.třídy a upozorňuje tak na možnost vzniku reakce štěp proti hostiteli po provedené transplantaci. MLC test může být použit i k zjišťování imunokompetence T lymfocytů u různých typů imunodeficiencí.

Test je prováděn ve dvou modifikacích:

1. Jednosměrný MLC test – v této variantě testu jsou stimulující buňky ozářeny nebo ošetřeny mitomycinem, což vede v obou případech ke ztrátě schopnosti syntézy DNA, aniž by buňky byly usmrceny. Naměřená odpověď je pak výhradně výsledkem syntézy DNA v respondujících (neozářených či mitomycinem neošetřených) buňkách. Tato modifikace umožňuje sledovat odpověď jednoho typu buněk.

2. Dvousměrný MLC test – v této variantě testu buňky obou jedinců se vzájemně stimulují i odpovídají. Naměřená syntéza DNA je pak sumou odpovědí obou typů buněk a jejich vzájemný podíl na zjištěném výsledku nelze rozpoznat.

Průběh testu:

Izolované lymfocyty (dárce, příjemce, popř. celá rodina, minimálně 2 typy kontrolních buněk s rozdílnými HLA antigeny II.třídy) jsou inkubovány v sérii jednosměrných kombinací, ve kterých je každý druh buněk jednak stimulující a jednak stimulovaný; jednotlivé buňky jsou vždy kombinovány se všemi ostatními vyšetřovanými druhy buněk (experimentální MLC).

Kultivace probíhá 5 dnů při 37°C v atmosféře 5 % CO₂. Během této doby dochází k syntéze DNA u stimulovaných buněk Poté je ke kultuře přidán na 12 – 18 hod. ³H-thymidin, který se inkorporuje do nově syntetizované DNA. Množství inkorporovaného ³H-thymidinu, které je úměrné syntéze DNA, je měřeno pomocí scintilačního spektrofotometru v impulsech za minutu (cpm).

Kontrolní kultury zahrnují společnou kultivaci syngenních ozářených a neozářených buněk (autologní MLC), což umožňuje stanovit “bazální” odpovídavost každého druhu stimulovaných buněk a dále pak kultivaci s buňkami s rozdílnými HLA antigeny II.třídy, což u jednotlivých druhů buněk ověří schopnost stimulovat i být stimulován (kontrolní MLC).

Každá kombinace buněk se inkubuje trojmo, vyšetření všech vybraných jedinců musí být vzhledem k přirozené variabilitě individuální buněčné odpovídavosti provedeno současně.

Výsledky MLC testu se udávají jako:

a) stimulační index (SI) – udává podíl výsledků měření radioaktivity v experimentální MLC a autologní MLC stimulovaných buněk:

cpm (stimulované vs.ozářené stimulující buňky) _{experimentální MLC}

SI = -------------------------------------------------------------------------------

cpm(stimulované vs. ozářené stimulované buňky) _{autologní MLC}

b) relativní odpověď (RR) – vyjadřuje vztah mezi odpovědí testovaných buněk v experimentální MLC a maximální odpovědí těchto buněk, které dosáhnou při stimulaci směsí alogenních buněk

cpm (experimentální MLC – autologní MLC)

RR = ---------------------------------------------------------------- x 100

cpm (kontrolní MLC – autologní MLC)

V MLC testu je hodnota SI ≤ 2 a RR 0-20 % považována za výsledek, který potvrzuje, že buňky dárce nestimulují buňky příjemce k proliferaci (je tedy vysoce pravděpodobné, že u vyšetřeného páru neexistují rozdíly v HLA antigenech II.třídy).

OSN-SLiteraturaOSN-E

Stites D.P., Terr A.I. : Základní a klinická imunologie, Victoria Publishing, Praha 1994

Dyer P., Middleton D.: Histocompatibility Testing: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, New York, Tokyo, 1993

OSN-SAutorské poznámkyOSN-E

Zuzana Ambrůzová

Schváleno 1.7.2002 ČLS - Společnost alergologie a klinické imunologie, sekce laboratorní imunologie.OSN-E