OSN-SAbstraktOSN-E

Měřením intenzity difúzně rozptýleného světla na dispergovaných částicích se zabývá nefelometrie. Rozptýlené světlo vychází z roztoku všemi směry (tzv. Tyndalovo světlo) a měří se pod úhlem, který je odlišný od směru dopadajícího záření. Konvenční nefelometry používají jako světelných zdrojů žárovku s halogenovou atmosférou nebo xenonovou výbojku. Optika těchto přístrojů obsahuje navíc interferenční filtr, neboť světelný zdroj po­skytuje polychromatické světlo. Detektor je nastaven pod úhlem 70 až 90°, protože stupeň směrovosti světla z konvenčního zdroje je nízký. Laserový nefelometr používá jako světelného zdroje helium-neonového laseru. Tento zdroj mono­chromatického světla je mimořádně intenzivní a má vysoký stupeň směrovosti. Laserový paprsek pro­chází přes kyvetu s měřeným roztokem a rozptýlené světlo se sleduje detektorem nastaveným pod úh­lem 5 až 35° (fotonkou nebo fotonásobičem).

 

OSN-SSouvisející informaceOSN-E

Turbidimetrie

 

OSN-STextOSN-E

Měření intenzity difúzně rozptýleného světla na dispergovaných částicích se zabývá nefelometrie.

 

Rozptýlené světlo (Ir) vychází z roztoku všemi směry (tzv. Tyndalovo světlo) a měří se (D) pod úhlem, který je odlišný od směru dopadajícího záření.

Pro nefelometrický měření jsou používány:

–         nefelometrický nástavec k fotometru (Tyndallovo světlo se sleduje pod úhlem 90°),

–         speciální přístroje - nefelometry

 

Konvenční nefelometry

Světelným zdrojem je obvykle žárovka s halogenovou atmosférou nebo xenonová výbojka.

Optika těchto přístrojů obsahuje navíc interferenční filtr, neboť světelný zdroj po­skytuje polychromatické světlo.

Detektor je nastaven pod úhlem 70 až 90°, protože stupeň směrovosti světla z konvenčního zdroje je nízký.

 

Laserový nefelometr

Laserový nefelometr používá jako světelného zdroje helium-neonového laseru. Tento zdroj mono­chromatického světla je mimořádně intenzivní a má vysoký stupeň směrovosti. Laserový paprsek prochází přes kyvetu s měřeným roztokem a rozptýlené světlo se sleduje detektorem nastaveným pod úh­lem 5 až 35° (fotonkou nebo fotonásobičem).

 

Pro přibližně stejné přístrojové vybavení obecně platí, že nefelometrie je asi o jeden řád citlivější než turbidimetrie. Schéma instrumentálního uspořádání je patrno z obrázku:

 

 

PRINCIP STANOVENÍ

Při nefelometrii se měří záření rozptýlené na částicích (obvykle komplexů antigen-protilátka), měří se tedy intenzita difúzního rozptylu.

Vlnová délka difúzně rozptýleného záření a záření zdroje je stejná, i když v malém rozsahu dochází na částicích k emisi záření o delší vlnové délce. Optimální poměr mezi vlnovou délkou záření monochromatického zdroje a polo­měrem částic je 10:1.

Nefelometrické měření se provádí nejčastěji ve dvou modifikacích, “end-point" nebo kinetické.

 

Měření “end-point”

·        měření po uplynutí určitého časového intervalu,

·        nejčastěji jde o dobu 30-60 minut, ale je známo, že již po 10 minutách je přítomno dost imunokomplexu pro reprodukovatelné měření

·        spolehlivost stanovení je též značně závislá na způsobu uchovávání reakčního produktu

 

Kinetické měření

·        využívá vyhodnocení rychlosti nárůstu zákalu v čase

Lze sta­novit minimálně 1 mg/l; vhodným přístrojovým uspořádáním za vy­užití výpočetní techniky je možno mez stanovitelnosti snížit o jeden až dva řády

 

Zákalové metody ve vodném prostředí jsou používány především pro imunochemické reakce, vyznačují se vysokou přesností a dobrou reprodukovatelností.

 

Závislost odezvy nefelometru  na koncentraci stanovované bílkoviny je obecně nelineární. Jde většinou o polynom druhého či třetího řádu. V případě vhodně zvolených pod­mínek je možno závislost aproximovat proložením přímkou. Obecně platí, že linearita měření je tím lepší, čím je koloidní disperze více naředěna nebo je menší velikost částic.

 

Stanovení specifických proteinů

Příkladem aplikace nefelometrie je stanovení jednotlivých plazmatických bílkovin. V současné době se prakticky výhradně používají imunochemické metody.

Jedná se o skupinu metod využívající specifickou reakci antigenu (plazmatické bílkoviny) s protilátkou (frakce zvířecího hyperimunitního séra). Reakcí antigenu s protilátkou vznikají imunokomplexy, na jejichž vizualizaci a kvantifikaci jsou pak založeny jednotlivé metodiky stanovení. Laboratorně velmi výhodné (z hlediska rychlosti provedení, přesnosti i produktivity práce) jsou optické metody, kdy reakce probíhá v kapalném prostředí. V pufru (nejčastěji fosfátový) za přídavku polyetylénglykolu 6 000 nastane precipitace imunokomplexů. Jejich koncentrace je při stálém nadbytku protilátky úměrná koncentraci antigenu, tj. stanovované bílkoviny ve vzorku.

 

Interference

Na zákalové měření koloidů mají vliv vlastní zákaly sér. Silně lipemická séra je nutno ze zpracování vyřadit. Důvodem je hlavně obtížnost měření malého přírůstku turbidance (absorbance, zákalových jednotek) komplexů antigen-protilátka na relativně vyso­kém pozadí zákalu. Při nefelometrickém měření se vzorky ředí ve vyš­ším poměru než u turbidimetrie; ani tam by však neměl porovnávací roztok vzorků přesáhnout 25 % RLS. Barviva - produkty hemolýzy a žlučové pigmenty (ikterická a hemolytická séra) - mají větší vliv na nefelometrii než na turbidimetrii.

 

Iontová síla vzorků

Ve fyziologickém rozmezí nemá významný vliv na reakci antigen-protilátka. Na stanovení má vliv použitý materiál reakčních nádob a jejich tvar (rovnoměrnost tvorby koloidně-disperzních komplexů a jejich stabilita), osvětlení (hlavně vlnové délky mimo viditelnou oblast) a teplota stanovení. Důležitý je vliv polyetylénglykolu.

 

Titr protilátek

Jde o orientační údaj, spíše jen o relativní hodnoty. Titry dvou šarží protilátek proti jedné bílkovině se mohou i dost výrazně lišit. S tím je třeba počítat při ředění protilátky a eventuální sní­žení titru kompenzovat nižším ředěním antiséra.

 

Některá omezení

Pro stanovení plazmatických bílkovin by se zásadně měly používat pouze protilátky k tomu účelu připravené. Pro zákalová měření koloidů jde o imunoglobulinové frakce příslušných antisér.

 

Afinita a avidita

Vysoká afinita znamená vysokou “příchylnost" protilátek k jejich odpovídajícím antigenním epitopům. Je podstatná pro rychlost reakce, zatímco avidita, která ovlivňuje tvorbu komplexů (částic), je důležitá pro měření “end-point". Obě charakteristiky nejsou nutně paralelní. Někdy může docházet i k vyloučení precipitátu, jestliže avidita a afinita jsou příliš vysoké. Tomu se dá zabránit změnou protilátky nebo snížením koncentrace polyetylenglykolu. Velmi rychlé reakce s vysoce afinními protilátkami mohou také být značným problémem při práci s automatickými analyzátory.

 

Vliv velikosti molekul bílkoviny

Velikost komplexů antigen-protilátka může mít svůj význam v nefelometrickém i turbidimetrickém měřicím systému.

 

 

OSN-SAutorské poznámkyOSN-E

Jaroslava Vávrová