OSN-SAbstraktOSN-E

Odstřeďování (centrifugace) je postup, který využívá odstředivé síly pro dělení látek různé hustoty, zrychluje rovněž proces sedimentace těchto částic. Rozdělování směsí kapalin nebo kapaliny a tuhých látek o různých hustotách pomocí odstředivé síly se provádí v centrifugách. Podle dosahovaného odstředivého zrychlení, resp. frekvence otáček, konstrukce a účelu, se centrifugy zhruba dělí na nízko-, středně- a vysokoobrátkové. Podle konstrukce rotoru se rozlišují rotory výkyvné a rotory úhlové.

OSN-SSouvisející informaceOSN-E

OSN-STextOSN-E

Odstřeďování je postup, který využívá odstředivé síly pro dělení látek různé hustoty, které by pouhým stáním, tj. tíhovou silou, postupovalo příliš pomalu nebo by prakticky neprobíhalo.V biochemické laboratoři patří k základním postupům, používaným k

– dělení směsí kapalin,

– odstranění sraženin,

– izolaci nebo odstranění buněk a subcelulárních částic,

– k frakcionaci makromolekul podle hustoty.

Centrifugy patří proto v klinicko-biochemické laboratoři k mnohostranně využívaným přístrojům.

Centrifugační síla (F) se počítá ze vzorce:

F = m . r . w² ,

kde m – hmota částic, r – poloměr, tj. vzdálenost dna centrifugační zkumavky od osy otáčení (uvedeno v dokumentaci rotoru), w - úhlová rychlost (w = 2 p n, kde n je frekvence otáček).

Součin r .w² [m.s²] odpovídá centrifugačnímu zrychlení.

Relativní centrifugační síla (R) vyjadřuje poměr mezi centrifugačním zrychlením a zrychlením tíhovým (relativní centrifugační síla tedy udává, kolikrát je vyvolané centrifugační zrychlení vyšší než tíhové zrychlení, udává se v násobcícb g , je bezrozměrné):

R = r . w² / g ,

(w = 2 p n)

Relativní centrifugační síla R se snadno vypočítá pro kteroukoli centrifugu a daný počet otáček:

R = 4,02 . n² . r ,

je-li frekvence otáček uváděna v [s^-1] a vzdálenost r v [m], nebo

R = 1,12 . n² . r . 10^-5 ,

je-li frekvence otáček uváděna v [min^-1] a vzdálenost r v [cm],

Místo výpočtu se k zjištění centrifugační síly používají nomogramy. Protože g = 9,81 m.s^-2, je přepočet dosud používané relativní centrifugační síly na centrifugační zrychlení snadný (např. 10000 x g odpovídá přibližně 100 000 m.s^-2 ).

O rychlosti sedimentace vedle centrifugační síly (tedy hmotnosti a centrifugačního zrychlení) rozhoduje rozdíl mezi hustotou centrifugované částice a rozpouštědla (přímo úměrně) a faktor tření (nepřímo úměrně).

Způsoby centrifugace

Diferenciální centrifugace

Základem pro dělení jsou rozdíly v sedimentačních rychlostech částic. Centrifugace probíhá v homogenním mediu s podstatně nižší hustotou, než jakou mají sedimentující částice (používá se např. vodný roztok sacharosy 0,25 mol.l^-1). Běhen centrifugace sedimentují různé částice různou rychlostí podle své velikosti. Dělení se provádí tak, aby určité částice jedné velikosti (tj. se stejným koeficientem sedimentace) zcela sedimentovaly. Diferenciální centrifugace se používá zejména k odstranění buněk, k oddělení sraženiny a při rozdělení buněčného homogenátu na částice (resp. při odstranění některých částic z homogenátu).

Izopyknická centrifugace v hustotním gradientu

Při tomto postupu se dosahuje rozdělení směsi částic na základě rovnovážné centrifugace. Centrifugace probíhá na principu rozdílu hustoty částic nezávisle na jejich ostatních vlastnostech. Používá se prostředí o měnící se hustotě (hustotní gradient), přičemž rozsah hustot leží v oblasti očekávaných hustot dělených částic. Hustoty média přibývá od horního okraje centrifugační zkumavky ke dnu. Během centrifugace sedimentu je částice jen potud, než se dostane do oblasti, v níž se její hustota shoduje s hustotou média (izopyknický bod). Zaujetí rovnovážné polohy vyžaduje více času (např. 30 h i více) než diferenciální centrifugace v prostředí s nízkou hustotou.

K přípravě hustotního gradientu se nejčastěji používají roztoky sacharózy, polymerů (dextran, albumin, polyethylenglykol) a solné roztoky (např. CsCI). Existují dva typy hustotních gradientů – diskontinuální a kontinuální.

Diskontinuální gradient je tvořen několika různě hustými vrstvami. Dělené částice určité hustoty se soustředí na hranici mezi dvěma vrstvami.

Při kontinuálním gradientu je změna hustoty plynulá v celém rozsahu dráhy (zkumavky). Může být připraven lineární, konvexní nebo konkávní gradient.

Metoda hustotního gradientu se používá i k dělení makromolekulámích částic polymemího charakteru (bílkovin, nukleových kyselin) lišících se měrnou hmotností.

Typy centrifug

Podle dosahovaného odstředivého zrychlení, resp. frekvence otáček, konstrukce a účelu, se centrifugy zhruba dělí na nízko-, středně- a vysokoobrátkové. K vybavení běžné klinicko-biochemické laboratoře, provádějící standardní vyšetření, stáží zpravidla nízkoobrátkové a středněobrátkové centrifugy se zrychlením 2.10⁵ m.s^-2 (20 000 x g).

K sedimentaci menších částic, např. virů a makromolekul, a pro různé analýzy prováděné v laboratořích výzkumného zaměření jsou nezbytné vysokoobrátkové ultracentrifugy dosahující zrychlení více než 10⁶ - 10⁷ m.s^-2. Rotory těchto centrifug pracují ve vakuu, čímž se omezuje odpor vzduchu a tím vyvolaný vznik tepla třením.

Podle konstrukce rotoru se rozlišují rotory výkyvné a rotory úhlové. Výkyvné rotory se hodí pro menší zrychlení, úhlové rotory masivní konstrukce a hladkého povrchu umožňují dosažení většího počtu otáček a kratší doby dělení.

Pro centrifugaci v hustotním gradientu se s výhodou používají speciální tzv. zonální rotory, umožňující centrifugaci velkých objemů materiálu. Plnění i vyprazdňování rotoru může probíhat během jeho otáčení, čímž se zabraňuje promíchání gradientu.

OSN-SPoznámkyOSN-E

OSN-SAppendixyOSN-E

OSN-SLiteraturaOSN-E

OSN-SAutorské poznámkyOSN-E

Jaroslava Vávrová