Abstrakt
Kvantitativní
stanovení celkové bílkoviny v moči různými technikami, přepočet hodnot na
exkreci za časové období.
Seznam souvisejících dokumentů a textů
Kódy a názvy v
různých klasifikačních systémech
Bílkovina kvantitativně (moč, mozkomíšní mok, výpotek):
sazebník výkonů VZP : 81369
Bílkovina kvantitativně (moč, mozkomíšní mok, výpotek)
STATIM: sazebník výkonů VZP: 81129
Princip
Hlavní možnosti stanovení jsou (Engliš 1993) a)
denaturace bílkovin a turbidimetrické (nefelometrické) změření zákalu b)
kolorimetrické metody bez nebo s předchozí denaturací (vysrážení bílkoviny)
Kvantitativní kolorimetrické stanovení na principu barevné reakce je nejčastěji
prováděno s pyrogallolovou červení či biuretovým činidlem po vysrážení bílkovin
moče. Provádí se ve vzorku sbírané moče za 24 hodin, koncentrace bílkoviny v
g/l se přepočte na exkreci bílkoviny močí v g za 24 hodin. Alternativou jsou
specifická vyšetření hlavních močových bílkovinných komponent (turbidimetrie,
nefelometrie, separační, zvláště elektroforetické techniky).
Definice a
terminologie
Jde o rutinní metodu využívající barevné reakce bílkovin
(především albuminu) s barvivy s vysokou afinitou k proteinům.
Místo
provádění postupu
Močová laboratoř OKB.
Bezpečnostní
aspekty
Obecné předpisy bezpečnost při práci s biologickým
materiálem
Teorie,
použití, preanalytické požadavky
Indikační oblastí jsou všechny stavy, kdy očekáváme
některý z typů proteinurie. Kvantitativnímu vyšetření zpravidla předchází
zjištění pozitivity proteinurie při základním vyšetření detekčními proužky nebo
kyselinou sulfosalicylovou. Při známé nefropatii nebo jiné, extrarenální
patologii lze indikovat vyšetření i z důvodů monitorování progrese či regrese
choroby a ke zjištění efektivity terapie.
Novější postupy respektují skutečnost, že při časné
diagnostice proteinurií (zejména tubulárních, ale i dalších) je nutná detekce
specifických bílkovinných komponent v moči i při zatím negativní chemické
reakci (proužek, kyselina sulfosalicylová) a hodnotách kvantitativní
proteinurie, které jsou jen mírně zvýšeny nebo dokonce v normě. Proto se často
vyšetření doplňuje nebo i nahrazuje specifickým kvantitativním vyšetření
některých bílkovinných komponent a hodnotí podle diferenciálně diagnostických
algoritmů. Podrobnosti jsou v DU_PROTEIN
K vyšetření se používá nativní moč. Vzhledem k linearitě
barevné reakce je nutné při hodnotách nad 3-5 g/l moč 10x naředit a znovu
provést vyšetření. Naopak zahuštění moči je nutné pro přesné kvalitativní,
např. eletroforetické vyšetření spektra močových bílkovin. Je nutné si uvědomit,
že každá manipulace s močovými bílkovinami nese značné riziko vzniku artefaktů
v jejich reaktivitě pro změny v terciální a kvarterní struktuře.
Po donesení materiálu je možno vydat výsledek týž den za
3-4 hodiny (podle počtu vyšetřovaných vzorků). Vyšetření nemá statimový
charakter.
Základní, v rozsahu SZŠ, obor laborant.
Postačuje běžný spektrofotometr. V současné době o typu
metody začíná, zejména na větších OKB, rozhodovat možnost její automatizace
(turbidimetrie, převedení barevných reakcí na analyzátory).
Znaky
analytické metody
Praktická stanovitelnost pro reakci s nejlacinějším
biuretovým činidlem se udává od 0,10 - 0,15 g/l, tj. od zhruba od horní hranice
ještě fyziologické proteinurie. Jiná používaná barviva mají citlivost až o 1-2
řády nižší (Coomasie blue, pyrogallolová červeň - viz Repetitorium DU_PROTEIN
Horní mez referenčního rozmezí je pro biuretovou metodu
0,15 g/l, linearita stanovení do 1,5 g/l. Údaje pro další barviva jsou v
tabulce (Engliš, 1993) a v DU_PROTEIN
Vyšetření se provádí zásadně v dubletech (platí pro
standard, kontrolu i vzorky). Reprodukovatelnost v řadě za sebou a mezi dny je nutné na každém pracovišti ověřit
pro používaný postup. Správnost vyšetření je rozhodující měrou ovlivněna typem
kalibračního standardu. Jednak je nutná jako při všech analýzách matrix shodná
se vzorkem (moč), jednak vhodné zastoupení různých typů bílkovin ve standardu.
Toto je řešeno nejjednodušeji přídavkem séra s přesně kvantitativně určenou
hodnotou celkové bílkoviny do bezbílkovinné močové matrix. Někdy používanou
navážku lyofilizovaného albuminu do moče nebo dokonce fyziologického roztoku
lze považovat za porušení zásad SLP. Problém naprosto exaktního vyšetření
proteinurie a optimálního močového kalibrátoru je principiálně neřešitelný proto,
že moč (zvláště patologicky změněná) obsahuje různé proporce nepolypeptidových
složek (Engliš 1996, v monografii Schück et al.) s různou, zpravidla nízkou
afinitou k použitému barvivu. Americká společnost klinické biochemie doporučila
jako tzv. vybranou metodu modifikaci biuretové metody dle Dotesche a Gadsdena
(Engliš, 1993), která používá gelové filtrace a je tedy pro rutinní použití
nevhodná.
Odběr
materiálu
Pacient donese celý objem nasbírané moči za 24 hodin.
Měl by být o dodržení času a kompletního sběru náležitě poučen. Moč se po dobu
sběru uchovává nejlépe v ledničce nebo alespoň v chladné místnosti, bez
konzervace. Při sběru je nutná základní hygiena (omytí genitálií vodou),
vyšetření se neprovádí při menstruaci a při masivním vaginálním fluoru. Použití
katetrizované moči je například nutné zavedeném permanentním katetru, jinak
zcela výjimečně. Při známých problémech s exaktním sběrem moči, jejím uchováním
a transportem se uvádí jako ekvivalentní nebo i lepší alternativa použití druhého
denního mikčního vzorku a stanovení koncentrace bílkoviny některou z uvedených
metod s přepočtem na kreatinin v moči (Hofmann, 1989). Tento postup ale nelze
doporučit při podezření na ortostatickou proteinurii. Další poznámky jsou v DU_PROTEIN
Použití konzervačních činidel se obecně týká sběru moči
po dobu 12 - 24 hodin a jejího transportu k vyšetření zejména tam, kde je
zvýšené riziko bakteriální kontaminace nebo přerůstání endogenní bakteriální
flóry a degradace některých močových komponent - bílkovin, glukózy apod. Týká
se zvláště moče s pH nad 7, při uchování a transportu sběrných nádob bez
dostatečného ochlazení zvláště v letním období apod. Pokud je sbíraná moč v
lednici, je bílkovina a většina dalších analytů stabilní po dobu 48 hodin.
Doporučených konzervačních prostředků je řada, ale žádný není zcela bez rizika
interference. Pro stanovení kvantitativní proteinurie lze použít prakticky jen
konzervaci chladem (+ 4-6 st.C). Při zmražení je vždy nutné pomalé a šetrné
rozmražení a obecně bude tento postup při vyšetření proteinurie spíše výjimečný
a zatížen vyšší chybou ve správnosti výsledku. Další konzervační možnosti jsou
v dokumentu „U_preanalytika doplněk“.
Manipulace s
materiálem
Vyšetření se provádí v den donesení vzorku. Vzorek je
možné uchovat až týden při 4 °C. Zmražení vzorku se nedoporučuje pro vznik
bílkovinných polymerů, jejichž rozpouštění je nekonstantní a mohou výsledek
významně ovlivnit. Objem moče se pečlivě změří, promíchá a odebere se vzorek
pro další analýzu. Pokud je moč zakalená nebo vzniká spontánně sediment, je
nutná centrifugace (stačí 10 minut při nejvýše 800 g, jinak je nebezpečí ztráty
bílkovin jejich rozpadem a mechanickou retencí v sedimentu).
Přístroje a
pomůcky
Spektrofotometr pro viditelnou oblast (dle maxima
absorbance daného barviva), běžná centrifuga, lednice. Automatické pipety pro
dané objemy. Při turbidimetrii či nefelometrii příslušné fotometry (340 nm)
nebo nefelometry. V případě stanovení Bence-Jonesovy bílkoviny vodní lázeň 56
°C.
Reagencie
Použitá barviva jsou podrobně zhodnocena v monografii
(Engliš, 1993) a v DU_PROTEIN Nejlevnější buiretové reagens je dodáváno
připravené, uchovává se při 4 °C. Jde o alkalický roztok síranu měďnatého,
Na-K-tartarátem a kaliumjodidem. Příprava ostatních barviv je dána u komerčních
preparátů firemními doporučeními, jinak je lze nalézt v literárních odkazech
položky Repetitoria DU_PROTEIN. K precipitaci bílkoviny se nejčastěji používá
20% kyselina trichloroctová (alternativně kyselina sulfosalicylová,
benzethonium-chlorid aj.) Při stanovení jednotlivých proteinových komponent
moči se užívají protilátky různých firem (DAKO, Roche Boehringer Mannheim
apod.), podmínkou je jejich vysoká afinita umožňující vyšetření nativní moče
(sensitivita s mezí detekce kolem 1 mg/l).
Spotřební
materiál
10ml plastové zkumavky, špičky k pipetám.
Kalibrace
Jak bylo výše řečeno, je složení standardu a kontrol pro
správnost výsledku rozhodující. Obecně platí, že čím vyšší je podíl albuminu v
kalibračním (standardním) materiálu, tím více mohou být v průměru výsledky
proteinurie podhodnoceny. Nejčastěji je standard připravován přídavkem známého
množství sérových bílkovin do bezbílkovinné močové matrix. Pro stanovení
hmotnostní koncentrace přidávané sérové bílkoviny je nejpřesnější použít
modifikovanou metodu dle Kjeldahla a případně výslednou koncentraci močového
proteinu kontrolně stanovit s upravením metody na některém z analyzátorů.
Kalibrační standard a kontroly (Biotrol-Merck, BioRad aj.) uchováváme v lednici
při +4 °C (trvanlivost je asi týden). Zmražené alikvoty jsou zatíženy chybou
uvedenou v kapitole "Manipulace s materiálem". Používáme stejný alikvot
standardu a kontroly pro jednu sérii vyšetření.
Pracovní
postup
Objem donesené moče přesně změříme a promícháme. Při
významnějším zákalu nebo spontánní tvorbě sedimentu 10 ml alikvot moči
centrifugujeme (10 min, nejvýše 800 g) při pokojové teplotě. Všechna další
vyšetření provádíme v dubletech. Ke 2 ml moče (nativní nebo při zákalu
centrifugované), 2 ml kalibračního standardu, 2 ml kontroly a 2 ml barevného
(např. zde biuretového činidla - blank) přidáme 0,4 ml 20% kyseliny
trichloroctové. Promícháme a necháme stát při pokojové teplotě 10 minut. Pak
zkumavky centrifugujeme 10 minut při 2500 otáčkách při pokojové teplotě.
Odsajeme pečlivě celý supernatant tak, abychom nezvířili sediment. Přidáme 2,5
ml biuretového činidla, důkladně promícháme do rozpuštění sraženiny a necháme
15 minut stát. Měříme na běžném spektrofotometru ve kyvetách o síle vrstvy 1 cm
proti slepé zkoušce při vlnové délce odpovídající maximu absorbance ( pro
biuret 550 nm).
Dokumentace,
zpracování a hodnocení dat
Proteinurii/24 hodin vypočteme dle vzorce:
g/ den = absorbance vzorku/absorbance standardu • konc.
standardu g/l • objem moče v l/24 hodin
Standard a kontrola bývají připravovány v rozmezí 0,3 -
0,5 g/l. Výsledky v podobě koncentrace proteinu v g/l a objemu změřené moče v l
se zadávají do systému LIS, který provede uvedenou kalkulaci a vytiskne
obvyklým způsobem výsledek. Jako normální je uváděna hodnota do 0.15 g/24h.
Způsob
vydávání výsledků
Výsledky jsou distribuovány nestatimovým způsobem
obvyklým v daném OKB.
Řízení jakosti
Vnitřní kontrola je dána použitím vlastního kontrolního
materiálu v každé sérii. Dle (Friedecký, 1996) lze pro SEKK využít komerčních
vzorků obsahujících lyofilizát moče (Biotrol-Merck, koncentrace 0,41g/L). Konstrukce
kalibračních a kontrolních materiálů by měla odpovídat poměrnému zastoupení
jednotlivých komponent v moči, tj. vedle
albuminu by měl být zastoupen i IgG, alfa-1-mikroglobulin,
alfa-2-mikroglobulin, alfa-2-makroglobulin, ev. i kappa řetězce. Pro vyšetření
jednotlivých bílkovinných komponent např. turbidimetrií je nutno pochopitelně
použít standardy a kontroly těchto purifikovaných proteinů.
Klinické údaje
Horní referenční mez kolem 0,15 g/d, jinak se za zcela
fyziologických okolností pohybuje proteinurie na hodnotách asi polovičních. Z
toho tvoří asi 30 mg plasmatické bílkoviny a dalších 30-70 mg pochází z ledvin
či močových cest. V případě těžkých nefrotických syndromů může proteinurie
dosahovat i několika desítek gramů bílkoviny za den a ovlivňovat celkovou
dusíkovou bilanci (6,25 g bílkoviny odpovídá 1g N). U hraničních a nízkých
proteinurií (zvláště prerenálního či tubulárního původu) může být citlivost barevné reakce malá. Tak
mohou časná stadia glomerulopatií a prognosticky závažné tubulární proteinurie
uniknout pozornosti při falešné negativitě výsledku.
Další klinické údaje jsou v dokumentu DU_PROTEIN.
Poznámky
Vyšetření Bence-Jonesovy bílkoviny se provádí spíše
ojediněle. Jedním z důvodů je postupné kvantitativní hodnocení hlavních
komponent bílkoviny v moči, které zpřesňuje diferenciální diagnózu. Principem
vyšetření Bence-Jonesovy je průkaz exkrece dimerů těžkých a lehkých řětězců
monoklonálních imunoglobulinů u patologických (zejména monoklonálních)
gammapatií. Provádí se precipitací při 56 st.C za optima pH (4.9) a iontové
síly (acetátový pufr). Vyšetření je kvalitativní a negativita paraproteinemii
nevylučuje.
Jiné
související informaceOSN-E
U_preanalytika doplněk
Moč - kvantitativní vyšetření
Literatura
1. Schück, O., Tesař V., Teplan V. a kol.: Klinická
nefrologie , Medprint 1995, s. 19 - 20
2. Colombo, J.P., Peheim, E.: Klinisch-chemische
Urindiagnostik. Ed. Colombo J.P., LABORLIFE Verlaggemeinschaft, 1994.
4. Masopust, J.: Požadování a hodnocení biochemických
vyšetření. I.část. Zdravotnické aktuality 216, Avicenum 1990.
5. Engliš, M. : Proteinurie. nakl. STAPRO, 1993..
6. Nejedlý, B.,Tobiška, J.,Zahradníček, Z.: Základní a
morfologické vyšetření moče. Účelová publikace ministerstva zdravotnictví ČSR
1988
7. Hofmann W., Gader W.G.: Preanalytische and
analytische Faktoren bei der Bestimmung von IgG, Albunin, alpha-1-Microglobulin
und Retinol-bindendes Protein im Urin mit dem Behring Nephelometer System
(BNS). Lab. med., 13, 1989, s. 470 - 478.
8. Friedecký, B., Kratochvíla, J., Budina, M.: Kontrolní
cyklus SEKK k posuzování jakosti vyšetřování moče diagnostickými proužky.
13/96. FONS, leden 1996, s. 13 - 16
Appendixy
Stručný popis
postupu
Autorské
poznámky
Doporučení, recenze, schválení