Abstrakt
Vysokoúčinná kapalinová chromatografie dosahuje vysoké
účinnosti a rychlosti dělení látek použitím kolon plněných velmi jemnými
sorbenty, při použití vysokotlakých čerpadel mobilních fází lze pracovat s velkými
průtoky mobilních fází, průtokové detektory umožňují citlivou kontinuální
detekci.
Související informace
· Chromatografie
· Chromatografie kapalinová
Text
Text je zpracován v odstavcích, které se zabývají těmito
hesly:
1.
Zásobník
mobilních fází
2.
Čerpadla
3.
Dávkovací
zařízení
4.
Kolona
5.
Detektory
6.
Chromatografie
iontových párů
1.
Zásobník mobilních fází
Mobilní fáze (zpravidla směsi
organických rozpouštědel nebo vodné roztoky pufrů) se před použitím filtrují
(odstranění nečistot) a odplyňují (např. s použitím ultrazvukové lázně). Do
systému HPLC jsou čerpány nejčastěji ze skleněných lahví. Do lahve zasahuje
čerpací hadička opatřená často skleněnou fritou, zároveň mobilní fází z důvodu
dokonalého a soustavného odplyňování trvale probublává hélium (jinou
alternativou odplyňování je použití membránového degasseru). Zásobník mobilních
fází má maximálně čtyři pozice pro současné čerpání a směšování mobilních fází.
2.
Čerpadla (pumpy)
Moderní instrumentace umožňuje
pracovat s tlaky až 60 MPa. Důležitá je vysoká přesnost a reprodukovatelnost
průtoků v celé škále pracovních tlaků. Čerpadla bývají dělena na pulzní a
bezpulzní, používají se pístová, membránová nebo pístově membránová, konstrukční
řešení v kombinaci s automatickým ovládáním zpravidla uspokojivě řeší
minimalizaci pulzů, materiálem pro výrobu čerpadel v HPLC je nejčastěji
nerezová ocel, safír, titan, keramika.
V kapalinové chromatografii se
využívá dvou modů čerpání mobilních fází:
a)
isokratický,
kdy je za stálého průtoku čerpána jedna mobilní fáze (jednosložková nebo
vícesložková předem smíchaná), alternativně lze čerpat zároveň ze dvou až čtyř
rezervoárů při konstantním poměru složek a konstantním průtoku,
b)
gradientový
mod, kdy v průběhu jedné analýzy lze programovaně měnit složení i průtok
mobilní fáze. Kvalitní chromatografické zařízení synchronizuje činnost ventilů
a čerpadel tak, aby gradientový profil byl reprodukovatelný.
3.
Dávkovací zařízení
Přímý nástřik vzorku injekční
stříkačkou přes septum nebo při zastavení toku mobilní fáze (stop-flow) přímo
na vrstvu sorbentu v koloně je metodou se špatnou reprodukovatelností, tedy
nevhodnou pro kvantitativní analýzu. Nástřiková zařízení se musí vyrovnat s vysokými
tlaky na koloně, používají se především dávkovací vysokotlaké ventily se
smyčkou. Dobře vybavená chromatografická zařízení mají k dispozici autosamplery
se zásobníkem vzorků (nejlépe s temperací) a s programovatelnou derivatizací
vzorku před analýzou.
4.
Kolona
Kolony pro HPLC jsou z
materiálu, který musí odolávat relativně vysokým pracovním tlakům a zároveň
chemickému působení mobilních fází a separovaných složek. Materiálem
chromatografických kolon je většinou antikorozivní ocel nebo specielně tvrzené
borosilikátové sklo, lze použít i kombinaci obou materiálů. Pro analytické
aplikace se převážně používají kolony plněné pórovitými náplněmi o průměru 3 -
10 µm o délce 5 - 30 cm a vnitřním průměrem 3 - 4 mm. Účinnost separace, doba
analýzy a pracovní tlak se zvyšují s rostoucí délkou kolony a naopak klesají s
rostoucím průměrem částic náplně. Při práci s kolonami o průměru menším než 2
mm se jedná o tzv. mikrokolonovou kapalinovou chromatografii, jejíž výhodou je
hlavně snížení spotřeby mobilní fáze i vzorku a zvýšení citlivosti detekce.
Materiály pro plnění kolon jsou většinou založeny na anorganické matrici
(silikagel, oxid hlinitý, pórovité sklo), na níž mohou být chemicky vázány nebo
zakotveny různé stacionární fáze, méně často se používá organických gelů různé
struktury, které mohou být rovněž chemicky modifikovány. Charakter stacionární
fáze závisí na chromatografickém systému. V HPLC se často vyskytují pojmy
"normální fáze" a "obrácená fáze". U normálních fází jsou
funkční skupiny stacionární fáze polární, mobilní fází bývá nepolární
rozpouštědlo (pentan, hexan). Chromatografie na tzv. systémech s obrácenými
fázemi (RP, reversed-phase, asi v 80 % všech aplikací HPLC) používá chemicky
vázanou nepolární stacionární fázi. Nejpoužívanější je typ C18, kde jsou
molekuly octadecylsilanu vázány na částicích silikagelu. Mobilní fáze v systému
RP je polární.
5.
Detektory
K detekci separovaných látek se
zpravidla užívá obecných nebo specifických vlastností, kterými se tyto látky
liší od mobilní fáze, na tomto základě se také rozlišují univerzální a
selektivní detektory. V laboratorní medicíně jsou nejčastěji používány:
5-1. Fotometrické detektory
(UV, VIS)
Většina organických látek
absorbuje v oblasti UV záření, některé i ve viditelné oblasti světla. Detektory
pracují buď s fixní vlnovou délkou (nejčastěji 254 nm), s možností výběru
několika vlnových délek (filtrové), nebo jsou opatřeny monochromátorem a
pracují na principu spektrofotometru v rozsahu 190 - 400 nm. Světlo zdroje
prochází průtokovou celou, intenzita prošlého paprsku je měřena fotonásobičem,
kontinuálně se snímá signál eluovaných složek.
5-2. Detektor diodového pole
(DAD)
umožňuje získat spektrální data látek v průběhu celé analýzy. Průtokovou celou
prochází polychromatické světlo, transmitované záření je spektrálně rozkládáno
holografickou mřížkou, takže na každou z miniaturních fotodiod umístěných na
destičce o délce cca 1 cm dopadá zářivý tok o určité vlnové délce zeslabený
absorpcí v průtokové cele detektoru. Použití DAD je podmíněno softwarovým zázemím,
které umožňuje např. průběžné hodnocení tzv. "čistoty píků",
identifikaci neznámých složek pomocí spektrální knihovny, rychlé stanovení
absorpčního maxima látky, kvantifikaci píků s odlišnými spektrálními
vlastnostmi v jedné analýze apod.
5-3. Fluorimetrický detektor je selektivní detektor s
vysokou citlivostí. Při měření fluorescence se budící UV záření ze zdroje vede
do průtokové cely, kde se absorbuje a vyzářené světelné kvantum o větší vlnové
délce se měří fotonásobičem.
5-4. Elektrochemický detektor umožňuje stanovit velmi nízké
koncentrace látek v eluentu v případě, že tyto látky jsou elektrochemicky
aktivní (redukovatelné nebo oxidovatelné). Měří se proud protékající mezi
polarizovatelnou pracovní elektrodou a pomocnou elektrodou v závislosti na
vloženém napětí. Detektor pracuje buď jako polarografický se rtuťovou kapkovou
elektrodou, nebo s tuhou elektrodou zhotovenou např. z grafitu. Obecně se tento
detektor nehodí pro detekci gradientové eluce.
5-5. Vodivostní detektor měří elektrickou vodivost
eluátu vytékajícího z kolony dvěma elektrodami (nerez, zlato, platina)
umístěnými v průtokové cele. Tento detektor je vhodný pouze pro detekci iontů.
5-6. Hmotnostní detekce
(LC/MS).
Snímání hmotnostního spektra
během eluce látek je velmi výhodné pro strukturní analýzu a identifikaci látek
ve složitých směsích. Technicky výhodné pro přímé napojení je používání
mikrokolon a kapilárních kolon. Principu hmotnostní detekce a využití v
kapalinové a plynové chromatografii jsou věnovány samostatné kapitoly.
Základní podmínkou použitelnosti detektoru je lineární
závislost odezvy v širokém koncentračním rozmezí stanovované látky a plná
automatizace záznamu. Oblast linearity je vymezena intervalem odezvy detektoru,
kdy odchylka od lineárního průběhu odezvy detektoru v závislosti na koncentraci
je menší než 2%. Směrnice lineární závislosti je mírou citlivosti daného
detektoru. Minimální detekovatelné množství složky (mez detekce) je určeno
nejmenším množstvím, které detektor prokazatelně zaznamená, přičemž odezva
detektoru se při mezi detekce má rovnat alespoň dvojnásobné hodnotě hladiny
šumu detekce. Šumem se míní kolísání odezvy detektoru způsobené náhodnými
změnami nulové linie (malá časová konstanta, vysoká frekvence). Driftem se
rozumí dlouhodobá nestabilita nulové linie při průtoku čisté mobilní fáze.
6.
Chromatografie iontových párů
Při chromatografii iontových
párů se využívá tvorby iontových asociátů (iontových párů) mezi dělenými
látkami iontové povahy, tedy anionty kyselin nebo kationty bází a opačně
nabitými ionty, obsahujícími lipofilní podíl. U iontového asociátu je celkový
náboj neutralizován, proto je hydrofobnější než původní kyselina, zásada, nebo
sůl a vykazuje výrazně vyšší retenci na nepolárních fázích. Jako protiionty pro
tvorbu iontových párů se zásadami se používají silné kyseliny (alkansulfonové
kyseliny) a jako protiionty pro tvorbu iontových párů s kyselinami slouží
kvarterní amoniové soli (tetrabutylamoniumsulfát). V chromatografii iontových
párů se zpravidla pracuje v systému kapalina-kapalina, kdy vodná stacionární
fáze obsahující příslušný protion je zakotvena na inertním nosiči, organická
nepolární fáze slouží jako eluent. Tato metoda se zpravidla používá v HPLC.
Poznámky
Appendixy
Literatura
Autorské poznámky