Metody molekulárně genetické diagnostiky

· Izolace nukleových kyselin

Izolace genetického materiálu je prvním krokem většiny molekulárně genetických technik. Skládá se z rozbití tkáně a buněk, izolace a čištění nukleových kyselin a stanovení koncentrace a čistoty získané nukleové kyseliny.

Izolace DNA spočívá v uvolnění DNA z vazby na jaderné proteiny a následném odstranění kontaminujících komponent. Klasickou metodou izolace DNA je fenol-chloroformová deproteinace, v současnosti jsou často využívány modifikace enzymatické degradace s vysolením, případně jsou využívány komerční soupravy založené na principu izolace s využitím iontoměniče

Izolace RNA je obdobou izolace DNA, zahrnuje však kroky zabraňující velmi rychlé degradaci molekul specifickými enzymy (ribonukloeázami). Patří sem např. fenol-chloroformová deproteinace, deproteinace guanidiniovými solemi nebo izopyknická centrifugace.

· Fragmentace DNA slouží k rozdělení genomové DNA na fragmenty definovaných délek. Nejčastěji se využívá fragmentace restrikčními endonukleázami (enzymy bakteriálního původu, také restriktázy), existují i způsoby fragmentace DNA využívající sekvenčně nespecifické enzymy (pankreatická deoxyribonukleáza I) nebo postupy mechanické.

· Hybridizační techniky jsou založeny na specifickém spojení komplementárních nukleotidových sekvencí pocházejících z různých molekul nukleových kyselin. Postupnými, na sebe navazujícími kroky jsou denaturace nukleových kyselin (rozdělení dvojvláknové molekuly na sense a antisense vlákno) a následná renaturace (annealing). Podle technického provedení rozlišujeme hybridizaci v roztocích, hybridizace na nosičích a hybridizaci in situ. Tyto metody se využívají při genové analýze a průkazu mutací. Metodami hybridizace na nosičích jsou Southern blotting a Northern blotting. Varianta sloužící k detekci specifického proteinu v heterogenní směsi je označována jako Western bloting. Hybridizace in situ je významnou metodou molekulární cytogenetiky.

· Analýza nukleových kyselin v gelech představuje postup využívaný k dělení nukleových kyselin podle délky řetězce a prostorové konformace (na rozdíl od klasické elektroforézy, která je závislá na poměru elektrického náboje molekuly a molekulové hmotnosti). Podle délky detekovaných fragmentů se využívá elektroforéza v agarovém gelu, elektroforéza v polyakrylamidovém gelu či elektroforéza v pulsním elektrickém poli.

Kromě prostého určování velikosti fragmentů nukleových kyselin jsou elektroforetické metody využívány i pro screening neznámých mutací. Typickými metodami jsou konformační polymorfismus jednovláknové DNA (SSCP - Single Strand Conformational Polymorphism) a denaturační metody: denaturační gradientová gelová elektroforéza (DGGE - Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) a teplotní gradientová gelová elektroforéza (TGGE - Thermal Gradient Gel Electrophoresis).

· Sekvenování DNA

Jde o metody určené ke stanovení pořadí nukleotidů v úseku DNA. Mezi typické představitele patří Sangerova dideoxynukleotidová metoda a chemická metoda Maxam-Gilbertova.

· Amplifikace nukleotidových sekvencí

Základní amplifikační metodou je DNA polymerázová řetězová reakce (DNA-PCR). Tato široce využívaná metoda má celou řadu modifikací, např. PCR-RFLP (AFLP), nested PCR, alelově specifická PCR (ASA-PCR ), multiplex PCR, asymetrická PCR, metoda analýzy heteroduplexů, automatizovaná real-time PCR aj. Variantou umožňující syntézu cDNA podle RNA templátu je reverzní PCR (RT-PCR). Mezi postupy, které nevyužívají k syntéze enzym DNA polymerázu patří např. ligázová řetězová reakce (LCR), či jiné amplifikační techniky (TMA, SDA aj.).

Literatura:

· Kaushansky K.: Glossary of Molecular Biology Terminology. Bangkok, 1999

· Křemen J., Pohlreich P., Stříbrná J.: Techniky molekulární biologie a jejich využití v medicíně. Karolinum, 1998

Další informace

· Klinická genetika: základní pojmy

· Klinická genetika

· Molekulární cytogenetika

Ivan Šubrt