Metrologie je věda zabývající se měřením. Měřením se rozumí soubor činností, jejichž cílem je stanovit hodnotu měřené veličiny. Legální metrologie je pak mezinárodně koordinovaná činnost, jejímž cílem je zajistit spolehlivost takových měření, která jsou předmětem právního dokazování. Zabývá se normalizací ověřování shody mezi požadavky definovanými legální metrologií a skutečnými podmínkami provádění zkoušek ve zkušebních laboratořích. Většinou tuto činnost zajišťují pověřené vládní či mezinárodní instituce (EU) pověřené metrologií, což jsou zpravidla národní metrologické ústavy či instituce.

 

Zkouška (examination, test) je technická činnost sestávající ze stanovení jednoho nebo více znaků produktu, procesu nebo služby s použitím specifikovaného postupu. Zkoušky se provádějí ve zkušebních laboratořích a nástrojem tohoto provádění je měření.

 

Klinická laboratoř (zdravotnická laboratoř, medical / clinical laboratory) je laboratoř specializovaná na provádění vyšetření (tj. měření a pozorování) majících vztah ke zdraví a nemocem. Nepovažuje se za zkušební laboratoř v technickém slova smyslu.

 

Kalibrační laboratoře provádějí stanovování hodnot v  kalibrátorech a produkují kalibrační funkce. Kalibračními laboratořemi disponují obvykle výrobci měřicích systémů, diagnostických kitů nebo referenčních materiálů. Zkušební laboratoře s nimi přicházejí do styku obvykle prostřednictvím dodávaných kalibrátorů a kontrolních materiálů.

 

Referenční laboratoře klinické chemie poskytují referenční hodnoty výsledků zkoušek. Hrají základní roli v procesech standardizace - normalizace a realizace návaznosti měření na vyšší úroveň (až po jednotky SI). Pro referenční laboratoře je typický mezinárodní charakter činnosti práce, při které bývají svázány do velmi sofistikovaných a efektivních sítí (např. NERL). V některých státech existují i ústavy (instituty) pro referenční měření speciálně pro účely zdravotnictví a nebo i běžné státní chemometrické a metrologické instituce mají pobočky zabývající se pouze referencí, chemometrií a metrologií ve zdravotnictví.

 

Měřicí princip je stručně vyjádřený vědecký podklad měření. Zkušební laboratoře používají pro svou činnost obvykle několika málo dobře zvládnutých a osvědčených principů.

 

Měřicí analytická metoda je definována jako logický sled obecně popsaných operací, použitých při měření, jde o rozvinutý popis měřicího analytického principu.I proto, aby bylo možno spolehlivě určit možné zdroje nejistoty analytického postupu, je vhodné rozdělit postup analýzy na sled vzájemně navazujících kroků, zahrnující vzorkování a úpravu vzorku, použití certifikovaných referenčních materiálů, kalibraci, vlastní analýzu, zpracování dat, prezentaci výsledků a interpretaci. Každý z těchto kroků ještě může sestávat z několika složek, které mohou dále přispívat k jeho nejistotě.

 

Jako praktický příklad lze uvést metodu stanovení hemoglobinu A1c (HbA1c) pomocí HPLC.

 

Metoda stanovení hemoglobinu A1c (HbA1c) pomocí HPLC

Odběr vzorku nesrážlivé krve do EDTA

Izolace erytrocytů centrifugací

Promytí erytrocytů roztokem NaCl k odstranění labilních Schiffových bází

Lýza erytrocytů vodou

Naředění hemolyzátu

Nastavení podmínek pro chromatografickou separaci

Nástřik na kolonu chromatografu

Separace HbA1c

Detekce píku HbA1c

Porovnání píku HbA1c s etalonem a kvantifikace

Prezentace chromatogramu a porovnání tvaru (např. určení dysmorfie hemoglobinu)

Interpretace výsledku stanovení hemoglobinu A1c

 

Měřicí postup je detailní popis pracovních operací, použitých při měření. Popis musí být natolik podrobný, aby umožnil bezproblémové provedení měření bez jakýchkoliv dodatečných informací. Hlavním důvodem potřeby důkladného popisu je eliminace nebo redukce řady zdrojů nejistot měření. Právě nedokonalý a nejednoznačný měřicí postup je nevyhnutelně zdrojem řady významných nejistot měření, které vznikají jako následek informačního šumu nebo prostého nedostatku informací.

V rámci systému správné laboratorní praxe je definován standardní operační postup (SOP), na který jsou kladeny následující požadavky:

 

Měřicí systémy jsou uspořádané soubory přístrojů, zařízení, reakčních činidel, kalibrátorů, potřebných k realizaci procesu měření. Pro měřicí systémy je typický různý stupeň integrace od poměrně jednoduchých diagnostických kitů až po kompletní integrované systémy slučující preanalytické, analytické a postanalytické procesy do jediného funkčního celku (TLA -Total Laboratory Automation).

 

Měřicí signál (odezva) je fyzikální hodnota resp. změna fyzikální hodnoty, způsobená měřenou veličinou a indikovaná detektorem měřicího přístroje. Citlivost, s jakou přístroj indikuje odezvu, určuje mez detekce měření. Odezvu, kterou nelze s dostatečnou pravděpodobností přiřadit k měřené veličině, označujeme jako přístrojový šum. Požaduje-li se po nás přepočet odezvy na hodnotu měřené veličiny, musíme použít  kalibrace. Výjimečně není nutné použít kalibrace pouze v těch případech, kdy je velikost odezvy v exaktním kauzálním vztahu s některým z fyzikálních zákonů a lze ji pomocí něho přímo přepočíst na hodnotu měřené veličiny. V tomto případě mluvíme o absolutních metodách měření. S těmi se však v praxi zkušební klinické laboratoře nesetkáváme. Jsou používány v omezeném množství pouze v kalibračních a referenčních laboratořích (gravimetrie, odměrné titrace, coulometrie apod.).

 

Absolutní (definitivní) a referenční metody (viz Příklad 031: Referenční metody) a postupy měření jsou postupy charakterizované

 

Důsledkem uvedených vlastností je vysoká úroveň pravdivosti a nízká hodnota nejistota měření. Absolutní a referenční metody vyhovující uvedeným charakteristikám jsou podrobeny procesům certifikace. Seznam vybraných důležitých certifikovaných metod/postupů je uveden v příkladu popisujícím referenční metody měření v klinických laboratořích.

 

Referenční materiály jsou analytické měřicí standardy - etalony, které prezentují ztělesnění jednotek látkových, hmotnostních nebo arbitrárních, obsahu, množství či koncentrací analytů. Základními vlastnostmi referenčních materiálů jsou

 

Základními funkcemi referenčních materiálů jsou například

Nedostatek vhodných referenčních materiálů je největší slabinou analytických měření v klinických laboratořích a nemůže být kompenzován pokroky technologie nebo elektronickou korekcí či kalibrací. Projevuje se jako nedostatek pravdivosti výsledků měření a jejich vnitrolaboratorní a mezilaboratorní porovnatelnosti. Nutno však poznamenat, že tento stav se rok od roku zlepšuje.

 

Referenční materiály zahrnují

 

 

Měřicí stupnice se definují v rámci měření a pro vydávání výsledků. Rozlišují se

 

Poměrné kvantitativní stupnice se někdy označují jako racionální (tj. nulová hodnota odpovídá nepřítomnosti analytu, takto se realizuje většina stupnic běžných měření) a diferenční (nulová hodnota je smluvenou hodnotou – příkladem je nulová hodnota base excess).

 

Výsledek měření je hodnota přisuzovaná měřené veličině získaná měřením (measurement). Nedílnou součástí výsledku měření je jeho nejistota. Označíme-li si hodnotu veličiny symbolem X a nejistotu symbolem U, pak se výsledek vyjádříme jako vztah:

 

Y = X ±U

 

Výsledky měření (výsledky zkoušek) jsou vyjadřovány v číselné formě, a pokud mají reflektovat skutečný stav zdraví či nemoci, musí být co nejbližší skutečnosti (skutečnému stavu). Z toho ovšem vyplývá nutnost základních znalostí pracovníků klinických laboratoří o zásadách, možnostech a limitech procesů měření. Z uvedeného požadavku vyplývá nutnost existence kalibračních a referenčních laboratoří a schopnosti vzájemné komunikace mezi nimi a zkušebními laboratořemi.

 

Skutečné hodnoty (true values) jsou hodnoty dokonale definovaných měřených veličin, získané dokonalým měřením. To znamená, že jsou principiálně nedostupné a musí být nahrazeny hodnotami  konvenčními nebo dohodnutými. V programech mezilaboratorního porovnávání zkoušek (MPZ) by měly být používány konvenční skutečné hodnty všude tam, kde je to možné, ale s podmínkou, že jejich nositeli jsou referenční materiály s dostatečnou úrovní komutability. V ostatních případech musí být použity různé typy středních hodnot souboru účastníků. Při řadě měření však nejsou ani střední hodnoty souboru účastníků použitelné a je nutné používat k porovnávání střední hodnoty účastníků používajících stejné měřicí metody nebo stejné měřicí systémy (stejnorodé skupiny – peer group).

 

Řetězec návaznosti má být nepřerušený a kompletní. Na každé úrovni řetězce musí být určena nejistota hodnoty a tato by neměla přesáhnout velikost potřebnou k požadovanému účelu. Schémata návaznosti mají charakter pyramidy, kdy mezi jejím nejvyšším stupněm (jednotkou měření SI) a nejnižším (výsledkem rutinního měření) je hierarchizovaný vztah. Hierarchizace platí z hlediska náročnosti na postupy a spolehlivost měření. Pro praxi platí opačná hierarchie -nejdůležitější jsou analytická měření rutinních laboratoří, zatímco referenční metody a referenční materiály by měly sloužit jako nezbytná podpora kvality měření v rutinních laboratořích. Existence návaznosti rutinních metod, prováděných ve zkušebních laboratořích, na referenční materiály a metody, zabezpečuje dostatečnou pravdivost jejich výsledků. Uvádí se, že nejistota měření se zvýší v řetězci návaznosti minimálně 3x. Návaznost lze v klinické laboratoři považovat za nejsilnější analytický nástroj k dosažení mezilaboratorní porovnatelnosti – k odvození hodnot pracovních kalibrátorů ze stejné referenční báze, nástroj k vyhodnocení a validaci pravdivosti (kvantifikaci systematické chyby měření). Prostřednictvím porovnatelnosti a pravdivosti lze docílit potřebné úrovně klinické interpretace výsledků měření prostřednictvím dobře definovaných referenčních intervalů a diagnostických rozhodovacích limitů.

 

 

Charakter změn nastávajících při pohybu v řetězci návaznosti od špičky vrcholu k základně pyramidy

Charakteristika

Změna

Finanční náklady

¯

Dostupnost

­

Nejistota měření

­

Pravdivost

¯

Poznámka: Směr šipky značí směr změny.

 

 

Kalibrace  nebo určení kalibrační funkce je realizovatelná pouze pomocí měřicích standardů - etalonů. Etalony je nutno považovat za ztělesnění, čili fyzickou realizaci jednotek měření.

 

Je nutné odlišit rozdíl mezi jednotou a etalonem. Jednotka je abstraktní pojem definovaný fyzikálními zákony a vykazující nulovou nejistotu hodnoty. Etalon je realizací jednotky formou standardního roztoku, referenčního materiálu, kalibrátoru a jeho hodnota je vždy zatížena určitou nejistota jejíž hodnota by měla být známa a měla by být vhodně nízká.

 

Analytické znaky metody vypovídají o kvalitě signálů, které se v rámci měření získávají. Analytické signály mají většinou povahu fyzikálních veličin, převedených vhodným indikačním systémem či detektorem na signál ve formě elektrického proudu. O intenzitě a jakosti signálu pak ve značné míře rozhodují základní analytické znaky metody. Mezi základní analytické znaky metod patří

 

Analytické znaky metody se zjišťují v rámci validace analytické metody.

 

Chyba měření (Error of measurement - Em) je definována jako rozdíl individuálního výsledku měření od skutečné hodnoty. Skutečná hodnota je ovšem idealizovaný pojem, protože je v principu neznámá. Lepší a v praxi použitelnou definicí chyby je rozdíl výsledku měření od konvenční skutečné hodnoty nebo od dohodnuté referenční hodnoty. Označíme-li si výsledek měření symbolem x, pak můžeme chybu měření vyjádřit těmito možnými vztahy:

Em = x - RMP

Em = x -

kde RMP je hodnota, získaná referenční metodou a  je průměr velkého počtu měření téhož vzorku (střední hodnota) v případě, kdy RMP není k dispozici. Hodnotu RMP lze ztotožnit s certifikovanou hodnotou certifikovaného referenčního materiálu. Hodnotu  lze ztotožnit s průměrem měření účastníků kontrolního cyklu EHK po vyloučení odlehlých hodnot. Chybu měření nelze tedy jednoznačně určit, ale lze ji velmi kvalifikovaně odhadnout. Odhad chyby bude exaktnější při existenci návaznosti měření na referenci, tedy při použití certifikovaných referenčních nebo aspoň mezinárodních nebo národních referenčních materiálů.

 

Chyba měření se obvykle prezentuje jako celková chyba měření (total error), v programech mezilaboratorního hodnocení kvality se využívá Z-skóre.

 

Náhodná chyba (random error - RE) výsledku měření je rozdílem individuálního výsledku měření od průměru velkého počtu měření při použití stejného vzorku. Náhodnou chybu nelze matematicky korigovat, lze ji ale snížit zvýšeným počtem měření (lze říci že  pro ). Náhodná chyba kolísá v čase a její velikost je nepredikovatelná. Typickým obrazem rozdělení souboru náhodných chyb v čase je Levey - Jenningsův regulační (kontrolní) diagram vnitřní kontroly kvality (často také nazývaný Shewhartův regulační diagram). Statistickým vyhodnocením náhodné chyby měření je přesnost měření, kterou lze určit jako opakovatelnost a reprodukovatelnost. Přesnost (opakovatelnost a reprodukovatelnost) měření je nutno považovat za základní parametry validace měřicí metody / analytického měřicího systému.

 

Systematická chyba (systematic error – SE) je rozdíl mezi průměrem velkého počtu měření a skutečnou hodnotou aproximovanou pomocí dohodnuté referenční hodnoty resp. konvenčně skutečné hodnoty. Systematická chyba je statisticky vyjádřena jako pravdivost (bias) měření.

 

Detekci náhodné a systematické chyby lze v klinických laboratořích provádět aplikací Westgardových pravidel v laboratorních programech vnitřní kontroly kvality. Právě použitím Westgardových pravidel v programu vnitřní kontroly kvality lze snadno detekovat chyby měření a rozlišovat mezi náhodnými a systematickými chybami.

Westgardův přístup vychází ze statistického pohledu na interní kontrolu kvality. Předpokládá, že i výsledek/ky kontrolního měření x je nezávislý na ostatních výsledcích kontrolních měření a odpovídá náhodné veličině Gaussovské populace se střední hodnotou  a směrodatnou odchylkou s. Na tomto základě jsou pak obvykle prezentována kontrolní pravidla (Westgardova pravidla) ve formě Xz.s. Pak X je počet nezávislých kontrolních měření - pozorování a z.s je určitý počet násobků analytické směrodatné odchylky s (podle gaussovského rozdělení). Obvykle se užívají kontrolní pravidla 11s, 12s, 12,5s či 13s.

Pravidla 12s a 13s detekují výskyt náhodné chyby měření. Pravidla R3s, R4s, , 22s detekují zase výskyt systematické chyby měření.

Westgardova kontrolní pravidla jsou vždy kompromisem mezi požadavkem na vysokou pravděpodobnost detekce chyby a na nízkou pravděpodobnost falešného zamítnutí.

 

Velmi užitečné pro využití a selekci kontrolních pravidel jsou grafické výkonové funkce (např. kontrolní počítačový program QC Validator© generující grafy typu OPSpec – Westgard QC Inc.).

 

Vybraná Westgardova pravidla pro detekci chyby a rozlišení jejího druhu

Detekce

Pravidla

Detekce náhodné chyby

13s, 12s, R4s

Detekce konstantní systematické chyby

41s, 22s,

 

Podrobněji lze aplikaci Westgardových pravidel demonstrovat na příkladu (Příklad 029: Aplikace Wetgardových pravidel).

Modely definující požadavky na analytickou jakost měření mohou vycházet z biologických rozptylů nebo z hodnoty bias, případně z hodnoty nejistoty.

 

Biologický rozptyl (celkový biologický rozptyl) je pro tyto účely vypočten z hodnoty rozptylu

 

Intraindividuální rozptyl (nebo individuální biologický rozptyl) udaný jako variační koeficient CVi [%] kvantifikuje fluktuaci hodnot obsahu či koncentrace složky či analytu u jedince s definovaným stavem zdraví, způsobené sezónními vlivy, malými změnami fyziologických dějů apod. Počítá se jako hodnota směrodatné odchylky výsledků měření vzorků stejných pacientů, pocházejících z nezávislých odběrů během časového období od několika hodin po několik týdnů až měsíců (chronobiologické studie).

 

Interindividuální rozptyl (též skupinový biologický rozptyl, biologická variace) kvantifikuje účinek stejných vlivů, jsou-li sledovány změny hodnot obsahu mezi jedinci vybraného souboru a označuje se CVg [%].

 

Celkový biologický rozptyl CVc [%] se pak vypočte jako kovariance obou typů podle vztahu

 

 

Vztah mezi požadovanou přesností měření CVa a biologickými rozptyly je dán rovnicí (Cotlove – Harris - Fraser)

 

CVa £ 0,5 . CVi [%]

 

 

Vztah mezi požadovanou hodnotou bias (Ba [%]) a biologickými rozptyly (Gowans et all. 1988) je dán vztahem

 

Vztahy mezi kontrolním limitem - mezí D [%] programu EHK a biologickým rozptylem lze též vyjádřit rovnicí

 [%] pro 95 % interval spolehlivosti

 [%] pro 99% interval spolehlivosti

 

Stejnými vztahy popisujeme celkovou chybu (nejistotu TEa) definovanou jako maximální povolenou odchylku od kontrolního limitu EHK. V detailní rozepsané podobě nabývají tyto vztahy následujících forem:

 

a) pro 95% interval spolehlivosti:

 

b) pro 99% interval spolehlivosti:

 

 

Požadavky na analytickou kvalitu lze z hlediska klinické použitelnosti formulovat do dvou souborů vztahů:

 

a) pro účely monitorování terapie platí:

 

kde je:

deltaSE... kritický rozdíl celkové chyby TE (změna hodnoty systematické chyby)

sa ... přesnost měření (analytická směrodatná odchylka)

si ... intraindividuální rozptyl vyjádřený směrodatnou odchylkou

 

To značí, že při sledování terapie by neměla hodnota přesnosti měření překročit poloviční hodnotu individuálního biologického rozptylu za předpokladu, že výsledky měření v čase nevykazují signifikantní systematickou diferenci, nebo že tato systematická diference by neměla překročit třetinu hodnoty individuálního biologického rozptylu, je-li přesnost měření velmi vysoká (například, je-li hodnota CV < 1,0 %).

 

b) pro použití výsledků laboratorních zkoušek v diagnostickém procesu platí:

 

kde je:

b ... bias

sa ... analytická směrodatná odchylka

sc ... celkový biologický rozptyl vyjádřený směrodatnou odchylkou

 

Uvedené vzorce jsou aproximací uvažující málo reálnou situaci, kdy buď hodnoty náhodných nebo hodnoty systematických chyb jsou zanedbatelné. Ve skutečnosti je nutné požadavky na přesnost a systematickou chybu měření, odvozené z biologických rozptylů, kombinovat podle řady různých modelových přístupů. Obecně je možno říci, že v případě vynikající přesnosti měření (například při použití velmi kvalitní a nově pořízené přístrojové techniky) lze mít poněkud nižší nároky na bias měření (například je možné snížit četnost kalibrací a rekalibrací), zatímco při nižší dosahované přesnosti měření rostou nároky na hodnotu bias měření které se mohou promítnout do častějšího provádění kalibrací a rekalibrací měřicích metod.

Celý přístup formulace požadavků na bázi biologických variací je velmi zajímavý a logický. Nicméně jeho aplikace v praxi je zatím omezená, protože v některých případech jsou biologicky odvozené požadavky analyticky i technologicky nedosažitelné, v jiných zase naopak příliš benevolentní.

 

Je-li realizována návaznost měření korektně, budou systematické faktory nejistoty eliminovány nebo redukovány v procesu kalibrace na hodnoty blízké nule () a přesnost měření, kombinovaná s případně existujícími faktory nejistoty typu B, bude představovat celkovou kombinovanou nejistotu měření. Ta část systematických faktorů, která zůstane i po kalibraci nekorigována, se projeví jako bias (pravdivost) měření. Laboratorní zkoušky, používané k diagnostické klasifikaci choroby, jsou často hodnoceny určením diagnostických rozhodovacích mezí - hodnot cut-off.

 

Jedním ze základních znaků analytické metody používané v laboratorní medicíně je na rozdíl od „klasické analytické chemie“ i určení klinické (diagnostické) správnosti. K tomuto účelu se rozdělí celá populace na dvě části: „zdraví“ a „nemocní“ (bimodální přístup). V případě rizika asociovaného s určitou částí populace (etnikum, věk atd.) se používá unimodálního přístupu.

 

U bimodálního rozdělení neleží obvykle rozhodovací diagnostická mez v průsečíku obou křivek. Její poloha závisí na tom, zda jsou v daném případě významnější a důležitější „falešně negativní“, nebo „falešně pozitivní“ výsledky, tedy zda má diagnostický proces větší nároky na citlivost (zda je nutno dosáhnout minima počtu falešných negativit), nebo na specifičnost (potřeba minimálního počtu falešných pozitivit). Nejefektivnější metodou určení vztahů mezi citlivostí, specifičností a potřebnou hodnotou diagnostického rozhodovacího limitu je ROC analýza.

 

Nenulové hodnoty bias virtuálně posouvají tyto teoretické limity k nižším hodnotám v případě negativního bias nebo k hodnotám vyšším v případě pozitivního bias. Při negativním bias dochází takto k zvýšení počtu falešně pozitivních diagnostických klasifikací, při positivním bias naopak k zvýšení počtu falešně negativních diagnostických klasifikací.

 

Kromě uvedených přístupů se v poslední době aplikuje přístup pomocí nejistoty měření. Tento přístup je založen na strategii eliminace nebo omezení všech zdrojů systematických složek nejistoty a musí začít dávno před vlastním procesem měření.

 

Korekce zdrojů systematických složek nejistoty

Před měřením

Při měření

Exaktní definice analytu

Dostatečná komutabilita kalibrátoru ()

Optimalizace vzorkování

Návaznost kalibrátoru na RM

Výběr metody o dostatečné specifičnosti a citlivosti (kontrola analytických znaků metody)

VKK a EHK

Dokonalý popis postupu (SOP)

Porovnávání za použití referenčních metod

 

Za podmínek, uvedených v tabulce lze laboratorní nejistotu jednak snadno a rychle hodnotit, dále pak přímo specifikovat podmínky analytické kvality měření v laboratoři a aplikovat je na interpretaci výsledků měření. Nejistota rozšiřuje „šedé zóny“ diagnostického rozhodování a tím snižuje diagnostickou účinnost zkoušek. Laboratorní diagnostika v oblasti „šedé zóny“ je nespolehlivá a v podstatě nemožná.

 

Další informace

Statistické postupy v laboratorní medicíně

 

 

Rejstřík

 

 

Bedřich Friedecký, Josef Kratochvíla, recenzoval Zdenek Kubíček