Abstrakt
Fotometrická reakce je nejrozšířenějším způsobem analýzy
v klinické chemii, fotometrické detektory patří do základní výbavy mnoha
speciálních analytických technik. Pro rutinní měření se používají fotometry
filtrové, hodnocení absorpčních spekter v určitých rozsazích vlnových délek
umožňují spektrofotometry.
Související informace
Spektroskopie
Text
Text je členěn podle osnovy:
A.
Princip
absorpční elektronové spektroskopie
B.
Lambert-Beerův
zákon
C.
Absorpční
spektra
D.
Fotometry,
spektrofotometry
a)
Absorbovaná energie
Chemické látky se liší
strukturou molekuly, tedy uspořádáním elektronů a atomových jader. Chemická
látka je stabilní při uspořádání s nejnižší energií. Dodáním energie (zářením,
nárazem elektronu, prudkým zvýšením teploty apod.) přejde molekula ze
základního do tzv. excitovaného stavu, tedy na vyšší energetickou hladinu.
Vzdálenosti energetických hladin odpovídají určitému energetickému stavu (stavy
valenčních elektronů, vibrační, rotační stavy). Elektronovým přechodům, které
vyžadují energii 300 - 1200 kJ/mol odpovídá ultrafialové záření, vibrační
přechody vyžadují desítky kJ/mol, což odpovídá infračervenému záření, rotační
přechody spotřebují desetiny kJ/mol (mikrovlnná oblast záření).
b)
Absorpční elektronová spektra
Podmínkou, aby sledovaná látka
absorbovala v ultrafialové nebo viditelné oblasti záření, je přítomnost
vazebných p elektronů ve vazebných molekulových orbitalech a
nepárových elektronů v nevazebných molekulových orbitalech. Životnost
excitované molekuly je velmi krátká (10-8 s), pohlcená energie se
často změní v tepelnou, která se absorbuje přítomným rozpouštědlem - nezářivý
přechod do základního stavu. Pokud molekula odevzdá získanou energii vyzářením
fotonu, vzniká rozptýlené záření. Chromofory jsou atomy, nebo skupiny atomů
silně absorbující v UV oblasti, zpravidla obsahují násobné (hlavně dvojné)
vazby.
c)
Barevnost látek
Absorpce látek v oblasti viditelného
záření, tj. v rozsahu vlnových délek 400 - 750 nm, vede k barevnosti látek.
Průhledná látka má barvu odpovídající záření, které sama neabsorbuje, barevný
roztok absorbuje záření doplňkové barvy (roztok, který se okem jeví jako
červený, absorbuje z viditelného světla především barvu modrozelenou,
neabsorbuje barvu červenou).
Prochází-li světelný paprsek prostředím, které je
schopno absorbovat, je intenzita paprsku vstupujícího vyšší než intenzita paprsku
prošlého tímto prostředím. Tento jev byl v roce 1729 poprvé formulován P.
Bouguerem a později ještě jednou objeven Lambertem.
Lze jej vyjádřit rovnicí: I = I0 * e-bd
kde:
I0 - intenzita vstupujícího paprsku
I - intenzita paprsku po průchodu absorbujícím
prostředím
d - vzdálenost od místa, kde paprsek vstupuje do
absorbujícího prostředí
b - absorpční (napierovský) koeficient
Převedením vztahu na dekadické logaritmy:
log
I/ I0 = log T = -a * d
kde:
T - transmitance (propustnost)
a - absorpční koeficient (lineární)
V r. 1852 ukázal Beer, že u mnoha roztoků vzniklých
rozpuštěním látek, jež absorbují světlo, je koeficient a přímo úměrný
koncentraci c rozpuštěné látky. Spojením Lambertova vztahu a Beerových poznatků
je popsán základní vztah pro spektrofotometrické metody chemické analýzy,
Lambert-Beerův zákon platný pro monochromatické světlo:
A
= ε * c * d = -log T = log I0/I
kde:
A - absorbance
c - koncentrace rozpuštěné látky
d - tloušťka absorbující vrstvy
ε - molární
absorpční koeficient
|
Lambda (nm) |
oblast |
barva
absorbovaného světla |
|
<380 |
ultrafialová |
neviditelná |
|
380 – 440 |
viditelná |
fialová |
|
440 – 500 |
viditelná |
modrá |
|
500 – 580 |
viditelná |
zelená |
|
580 – 600 |
viditelná |
žlutá |
|
600 – 620 |
viditelná |
oranžová |
|
620 – 750 |
viditelná |
červená |
|
750 – 2000 |
blízká IČ |
neviditelná UV -
blízká |
|
220 - 380 nm |
daleká |
< 220 nm |
|
Název |
Symbol |
Definice |
|
Absorbance |
A |
-log T = log I0/I |
|
Absorpční
koeficient |
a |
A/d * c (c v
g/l) (absorptivita) |
|
Molární
absorpční koeficient |
ε |
A/d * c (c v
mol/l) (molární absorptivita) |
|
Délka dráhy
paprsku |
d |
tloušťka vrstvy
(kyvety) |
|
Transmitance |
T |
I / I0 |
|
Jednotka vlnové
délky |
nm |
10-9
m |
|
Absorpční
maximum |
λmax |
vlnová délka při
maximální absorpci světla |
Na absorpčních křivkách se vyhodnocuje přítomnost maxim,
jejich intenzita, počet minim, inflexních a izobestických bodů.
Vlivem chemických změn např. zavedením další
charakteristické skupiny do molekuly nebo změnou použitého rozpouštědla nastává
posun absorpčního maxima:
-
posun
se změnou vlnové délky absorpčního maxima
-
posun
se změnou intenzity absorpčního maxima (tj. změnou molárního absorpčního
koeficientu)
Izobestický bod odpovídá jedné vlnové délce na
absorpčních křivkách acidobazických indikátorů představuje vzájemný přechod
mezi protonovou a neprotonovou formou v závislosti na pH, v tomto bodě je
molární absorpční koeficient pro obě formy stejný.
jednopaprskové:
-
zdroj
světla
-
vstupní
štěrbina
-
monochromátor
-
výstupní
štěrbina
-
kyveta
-
detektor
dvoupaprskové:
-
zdroj
světla
-
zrcadlem
rozdělení paprsku na dva rovnoběžné
-
dvě
vstupní štěrbiny
-
dva
monochromátory
-
dvě
výstupní štěrbiny
-
dvě
paralelní kyvety (vzorková + srovnávací)
-
dva
detektory zdroj světla
-
vstupní
štěrbina
-
monochromátor
-
výstupní
štěrbina
-
hranolem
a soustavou zrcadel vymezení dvou rovnoběžných paprsků
-
dvě
paralelní kyvety (vzorková + srovnávací)
-
oba
paprsky soustředěny soustavou zrcadel do jednoho místa, kde se intenzity
vzájemně odečtou
-
detekce
výsledného signálu jedním detektorem
Zdroje světla:
-
výbojky
(vodíková, deuteriová, xenonová) - pro blízkou ultrafialovou (UV) oblast,
-
žárovky
- žhavená wolframová spirála - pro viditelnou (VIS) a infračervenou (IČ)
oblast,
-
spektrální
lampy (monochromatické záření) - rtuťová výbojka, křemenné halogenové lampy.
Monochromátor:
-
vstupní
štěrbina
-
disperzní
prvek
-
zaostřovací
soustava
-
výstupní
štěrbina
Monochromatické záření je elektromagnetické záření velmi
úzkého oboru kmitočtů (vlnových délek). Monochromátory jsou optická zařízení
jimiž se ze spektra mechanicky vymezí jeho určitá část. Disperzním prvkem v
monochromátoru je hranol nebo mřížka. Vymezení úzkého pásu monochromatického
záření je dáno výstupní štěrbinou, požadovaná vlnová délka se nastavuje přímým
otáčením disperzního prvku. Nejvyšší kvalita monochromatického záření se
definuje jako "efektivní spektrální šířka pásu".
Možnost plynulé změny vymezení monochromatického záření
je využívána pro snímání spekter, přístroje tohoto typu jsou nazývány
spektrofotometry.
Filtry:
Vymezují ze spojitého záření nejužší pás
monochromatického záření:
-
barevné
- vrstvička oxidu kovu na skleněné podložce nebo želatinová vrstva vybarvená
organickým barvivem,
-
interferenční - využívají mnohonásobnou interferenci záření mezi mezními plochami s
dobrými odrazovými vlastnostmi.
Charakteristiku filtru dává jeho křivka propustnosti,
pološířka odpovídá intervalu vlnových délek při poloviční propustnosti filtru.
Čím je rozsah pološířky filtru užší, tím je filtr lepší. Přístroje s
vyměnitelnými filtry jsou určeny pro měření při vybraných oblastech vlnových
délek, slouží pro rutinní měření, jsou nazývány fotometry.
Kyvety:
Pro fotometrická měření se používají kyvety skleněné a
plastové (pro viditelnou oblast spektra) nebo křemenné pro měření v
ultrafialové oblasti. Tloušťka kyvety bývá obvykle 1 cm (při manuálním měření,
analyzátory s fotometrickou detekcí používají kyvety menších rozměrů), běžné je
i používání průtokových kyvet a průtokových cel.
Detekce:
Fotometrická detekce je založena nejčastěji na
fotoelektrickém efektu, kdy energie záření se přeměňuje na měřitelnou
elektrickou energii:
a)
hradlový
článek,
b)
fotonásobič,
c)
fotodiodové
pole.
Požadavky na laboratorní fotometr:
-
minimální
měřené objemy,
-
end
point reakce,
-
kinetické
měření,
-
lineární,
nelineární kalibrace,
-
programovatelnost
a uložení parametrů metod,
-
automatické
podavače pro sériové analýzy,
-
automatické
zpracování dat,
-
komunikace
s počítačovou sítí.
Autorské poznámky