OSN-SAbstraktOSN-E

Technika izoelektrické fokusace slouží k separaci látek, které mají zároveň kyselé i bazické skupiny. Využívá se toho, že při dosažení izoelektrického bodu je pohyblivost těchto látek nulová. Separace probíhá na gelech s vytvořeným gradientem pH.

 

 

OSN-SSouvisející informaceOSN-E

Elektroforéza

Elektroforéza-v polyakrylamidovém gelu

Elektroforéza-zónová

 

OSN-STextOSN-E

 

KEY-SIzoelektrická fokusaceKEY-E  (IEF)

Technika izoelektrické fokusace (izoelektrického zaostřování) patří k rovnovážným technikám, kinetický proces určuje pouze rychlost dosažení rovnováhy. Při separaci částic, které obsahují zároveň kyselé i basické skupiny (bílkoviny, peptidy, aminokyseliny) je dosažením izoelektrického bodu pohyblivost iontu nulová.

 

Oblast izoelektrické fokusace -  KEY-SamfolytyKEY-E

Velmi důležitými sloučeninami v elektroforéze jsou aminokyseliny. Podle volby pH mohou migrovat jak katodicky tak anodicky, což je dáno tím, že se jedná o amfolyty.

 

Příklad:

 

b-alanin           rozpuštěn ve vodě při pH = 7 existuje jako     "zwitterion"

 

  (NH2-CH2-CH2–COOH)                                                  NH3+-CH2-CH2-COO-

 

Amfolytický charakter aminokyselin je popsán disociačními konstantami číslovanými od kyselé oblasti do zásadité. Disociační konstanta K1 charakterizuje v kyselé oblasti protonizaci karboxylu, tedy proces, kdy se ze zwitteriontu tvoří kation, druhá disociační konstanta K2 se vztahuje k disociaci aminoskupiny, kdy se ze zwitteriontu tvoří anion. Pro b-alanin jsou hodnoty pK1 = 3,8 a pK2 = 9,6. Iontová mobilita kationtu (pro pH nižší než 3,8) je 36 * 10-5 cm2 V-1 s-1 a aniontu (pro pH vyšší než 9,6) 31 * 10-5 cm2 V-1 s-1. Je zřejmé, že aminokyseliny typu mono-amino-mono-karboxy v kyselém prostředí migrují katodicky (jako kationty) a v zásaditém prostředí migrují anodicky. Oblast prakticky nulové mobility (v uvedeném příkladu pro pH 6 - 8) je oblastí izoelektrické fokusace.

 

 

V oblasti pH = pI (pI = KEY-SKEY-SizoelektrickýKEY-E bodKEY-E ) se separace zastaví, s časem se zaostřují zóny, migrace působí proti difuzi.

 

Izoelektrická fokusace ve stacionárním  KEY-SpH gradientuKEY-E 

Působením elektrického proudu je vytvořen podél migrační dráhy v separačním loži stacionární pH gradient a amfolyty dávkované do libovolného místa migrační dráhy se pohybují směrem k té oblasti pH, kde jsou izoelektrické a stanou se z makroskopického hlediska nepohyblivé. Výsledkem analýzy je vytvoření série zón izoelektrické spektrum, které je stacionární podél separačního lože.

 

Vytvoření  KEY-SpH gradientu

Nejčastěji je používán způsob tzv. přirozeného gradientu pH. Gradient je tvořen elektrolýzou směsi amfoterních látek. Vytvoří se kvazistacionární stav, v němž se amfolyty uspořádají podle rostoucí hodnoty izoelektrického bodu pI od nejnižší hodnoty u anody (v elektrodové komoře je silná kyselina) k nejvyšší hodnotě poblíž katody (v elektrodové komoře je silná báze). Syntetické směsi amfoterních látek (ampholiny) jsou alifatické polyaminopolykarboxylové sloučeniny s molekulovou hmotností 300  - 1000 a s pI od 3 do 10. Jde o látky připravené kondenzací polyethylenaminů s kyselinou akrylovou.

 

Izoelektrická fokusace se provádí většinou v polyakrylamidovém gelu v tenkých vrstvách a užívají se pro ni stejná zařízení jako pro zónovou elektroforézu. Pracovní postup zahrnuje prefokusaci (bez vzorku), kdy se vytváří gradient pH, a následnou analytickou fokusaci se vzorkem.

 

Pro IEF lze použít jako vhodný nosič také agarózu, která má nulovou elektroosmózu. Její výhodou je snadná příprava gelu a zdravotní nezávadnost.

 

 

 

Analytické využití izoelektrické fokusace je velmi rozsáhlé a leží především v oblastech proteinů (proteiny jsou amfolyty).

 

OSN-SPoznámkyOSN-E

 

OSN-SAppendixyOSN-E

 

OSN-SLiteraturaOSN-E

 

OSN-SAutorské poznámkyOSN-E

Jaroslava Vávrová