Abstrakt
Lipoprotein Lp(a) představuje třídu lipoproteinových částic, jejichž
bílkovinnou složku tvoří apolipoprotein apo-B-100 a specifický glykoprotein
apolipoprotein apo(a) připojený k apo-B-100 disulfidovou vazbou. Jde o lipoproteinovou
třídu s molekulovou hmotností vyšší než 5,4 milionů, pohybující se při
elektroforéze samostatně v pre-beta1-oblasti, která však při
ultracentrifugaci mizí v LDL-frakci, odtud označení “sinking pre-beta“
resp. “zanořující se”. Lp(a) částice se podobá částici LDL s apo-B-100
disulfidicky vázanou na apoprotein apo(a), který představuje specifický
glykoproteinový marker této částice. Gen kódující apo(a) se nachází na dlouhém
raménku chromosomu 6 poblíž genu pro plazminogen. Hladiny Lp(a) podléhají
přísné genetické kontrole a jeví mendelovský způsob přenosu. V plazmatických
hladinách Lp(a) existují mezi jedinci výrazné rozdíly (řádově až 1000-násobné),
zatímco u téhož jedince jsou hodnoty relativně stálé. Plazmatické hladiny Lp(a)
jsou nezávislé na hodnotách jiných lipoproteinů a apolipoproteinů
Terminologie
Synonyma
Klasifikační kódy
Odkazy na jiné relevantní
dokumenty, další informace
Chemická a fyzikální
charakteristika, struktura a povaha analytu
Apolipoprotein apo(a) je glykoprotein obsahující asi 30 váhových procent
sacharidů a polypeptidový řetězec o velikosti 300-800 kD. Představuje
plazmatický marker lipoproteinu Lp(a). Apo (a) je vázán na minoritní část LDL částic a patří do rodiny proteinů zapojených do procesu
fibrinolýzy. Je to protein vysoce polymorfní, nejevící žádnou nápadnou
podobnost s jiným apolipoproteinem. Jeho základní jednotkou je tzv. “kringle”
(“smyčka“), struktura velmi častá právě u proteinů známých z procesu
fibrinolýzy. Jedná se o proteinovou doménu obsahující asi 80 aminokyselinových
zbytků, vzájemně spojených třemi vnitřními disulfidickými můstky, čímž dochází
k vytvoření zvláštního tvaru, který dává doméně její přívlastek
“kringlová” ~ “preclíková“ tj. podobající se známému dánskému pečivu.
Molekulová váha apolipoproteinu apo(a) se může u jeho četných polymorfních
variant velice lišit a je dána právě počtem “kringlů”. Apo(a) s obsahem 17 až více
než 30 “kringlů” se velmi podobá Glu-plazminogenu (plazminogen s kyselinou
glutamovou vázanou na N-terminálním konci), jehož molekulu tvoří 790
aminokyselinových zbytků a pět různých typů “kringlů” před doménou typu
serinové proteázy. Tato extrémní strukturní homologie apo (a)
s proenzymem fibrinolytického systému - plazminogenem spočívá
zejména v tom, že má stejnou proteázovou oblast a podobné, ne však
shodné domény tvaru složených smyček: “kringle 4“ a “kringle 5“. Na rozdíl od
plazminogenu nemá však apo(a) vůbec “kringle 1-3“ a navíc, což je zvlášť
významné, se “kringle 4“ v apo(a) vyskytuje v mnoha tandemových kopiích. Jsou
kontrolované několika alelami (minimálně 34), které charakterizují vysoce
polymorfní gen kódující apo(a), lokalizovaný na dlouhém raménku chromosomu 6
(6q26-27). Proteázová doména apoproteinu apo(a) se z 94 % podobá
proteázové doméně plazminogenu, na rozdíl od ní je však v proteázové
doméně apoproteinu apo(a) zaměněn serin za arginin. U apo(a) je přítomna stejná
katalytická triáda, charakteristická pro všechny serinové proteázy, místo
potenciální aktivace štěpené tkáňovým aktivátorem plazminogenu je výše uvedenou
záměnou aminokyselin modifikováno takovým způsobem, že k jeho aktivaci
dojít nemůže.
Variabilní
velikost apolipoproteinu apo(a) způsobuje heterogenitu velikosti a hustoty
Lp(a) a souvisí také s plazmatickými hladinami Lp(a). Bylo zjištěno, že
existuje inverzní vztah mezi velikostí apo(a), která je dána počtem opakování
kringlu 4 a plazmatickými hladinami Lp(a): malé izoformy apo(a) jsou
v krvi často sdruženy s vysokými koncentracemi Lp(a) a naopak velké
izoformy s koncentracemi Lp(a) nízkými. Populační studie ukazují maximálně dvě
izoformy apo(a) u jedné osoby, což je v souladu s hypotézou, že
molekulární váha apo(a) je určována dvěma alelami.
Role v metabolismu
Fyziologická funkce apo(a) nebo Lp(a) není známa. Téměř úplné chybění
Lp(a) v plazmě nezpůsobuje žádnou chorobu ani syndrom z jeho
deficitu. Hypoteticky se uvažovalo o roli Lp(a) při hojení ran, jako dodavatele
cholesterolu do míst zranění. Také jeho protrombogenní vliv ve smyslu zpevnění
krevní sraženiny mohl být na jistém stupni vývoje živočišných druhů pro jejich
vlastní přežití jistou výhodou.
Proatherogenní účinky Lp(a):
patogenní působení Lp(a) jako následek komplexní vazby s glykosamino- či
proteoglykany nebo změn oxidativních resp. modifikace Lp(a).
Lipoprotein Lp(a) je modifikovanou formou LDL cholesterolu schopnou vazby na endotel a složky extracelulární matrice, což vede k místnímu ukládání cholesterolu. V histologických studiích byly nalezeny lipoprotein Lp(a) a apolipoprotein apo(a) v aterosklerotických lézích a objevila se souvislost mezi zvýšenou koncentrací apolipoproteinu apo(a) v séru a jeho zvýšeným ukládáním současně s apolipropteinem apo-B-100.
Zjištění, že se tyto apolipoproteiny hromadí v intimě arterií, aterosklerotických plátech a koronárních by-passech z vena sphena magna, naznačují, že lipoprotein Lp)a) může vstupovat do interakcí s LDL cholesterolem a urychlovat aterosklerózu. Lipoprotein Lp(a) potencuje kritický časný krok rozvoje aterosklerózy resp. náchylnost LDL-cholesterolu k oxidaci. Lipoprotien Lp(a) vede k tvorbě od kyslíku odvozených volných radikálů v lidským monocytech. Nadbytek lipoproteinu Lp(a) u pacientů s heterozygotní familiární hypercholesterolémií působí funkční poškození endotel-dependentní vazodilatace a je též dáván do souvislosti s nadměrnou proliferací hladké cévní svaloviny.
Lp(a) může prostupovat endotelem stěny tepen a akumulovat resp.
imobilizovat se v intimě. Lp(a) zde vazbou na fibrin, fibrinogen,
fibronektin a glykosamino- či proteoglykany může přispívat
k extracelulární akumulaci esterů cholesterolu v cévní stěně. Lp(a)
může poté v cévní stěně podobně jako LDL podléhat oxidativní modifikaci a
ve své modifikované podobě může být vychytáván prostřednictvím tzv.
“scavenger receptorů“ v endotelu přítomných makrofágů. Fagocytózou a degradací
uvnitř těchto elementů se makrofágy mění na tzv. pěnové buňky, potenciální
prekursory aterosklerotických plátů. Výše zmíněná modifikace Lp(a) je
uskutečnitelná experimentálně a prokázanými modifikátory jsou např.:
malonyldialdehyd, transglutaminása, sulfhydrylové sloučeniny, homocystein,
některé látky s oxidačními účinky. Díky své struktuře je však lipoprotein
Lp(a) považován za lipoproteinovou částici nejen s aterogenním,
ale i trombogenním potenciálem. Vzhledem k velké podobnosti apo(a)
s plazminogenem může totiž Lp(a) zasahovat do procesu fibrinolýzy tím, že se
váže na plazminogenové receptory na povrchu fibrinogenu a fibrinu a inhibuje
tak vazbu plazminogenu na tyto substráty, čímž brání aktivaci lokální
fibrinolýzy. Soutěží též s plazminogenem o vazbu na receptory na površích
endoteliálních buněk a brání zde tak tvorbě plazminu. Podle experimentálně
zjištěné rozdílné schopnosti vázat se k lysinu (lysin-Sepharóze) se Lp(a)
dělí na dvě frakce: Lp(a) lysin+ a Lp(a) lysin-. Frakce Lp(a), která se na
lysin neváže, neinhibuje aktivaci plazminogenu. Schopnost vazby na lysin není
dána typem izoformy apo(a), ale posttranslačními změnami (záměnou některých
aminokyselin na kringlu, který lysin váže). Vysoký poměr
Lp(a)lysin+/Lp(a)lysin- společně s vysokými hladinami Lp(a) může zvyšovat
inhibici fibrinolýzy a může podporovat inkorporaci Lp(a) do cévní stěny. Opačný
poměr při současně vysoké hladině Lp(a) může riziko aterogeneze a trombogeneze
snižovat. Lp(a)lysin+ má větší aterogenní potenciál, zdá se však, že měření
jednotlivých subfrakcí nemá větší prediktivní schopnost než stanovení celkových
hladin Lp(a).
Lp(a) představuje nezávislý rizikový faktor předčasného vývoje aterosklerózy kardiovaskulárního aparátu, neboť vykazuje významnou nezávislou korelaci s onemocněním koronárních cév.
Za vysoce rizikové bývají označovány koncentrace >300 mg/l.
V současnosti je Lp(a) považován za parametr s trombogenním i
aterogenním potenciálem a za nezávislý rizikový faktor předčasné aterosklerózy.
Některé studie ukazují na úzké spojení mezi zvýšenými hladinami lipoproteinu
Lp(a) a rozvojem předčasné aterosklerózy koronárních a mozkových arterií.
Sérové hladiny Lp(a) >
200 mg/l, které jsou přítomny u cca 20% běžné populace představují jedno
z hlavních rizik pro rozvoj koronární aterosklerózy. Zvýšené hladiny Lp(a)
lze nalézt dvakrát až pětkrát četněji u pacientů s předčasným onemocněním
srdce než u normální populace.
V řadě epidemiologických studií byla prokázána pozitivní korelace
vysokých hladin Lp(a) s ischemickou chorobou srdeční (ICHS). Rodinný
výskyt dyslipidémie Lp(a) byl též nejčastější abnormalitou v rodinách osob
po prodělaném předčasném infarktu. Byla popsána významná korelace hladin Lp(a)
se stupněm koronárního postižení ve studiích založených na arteriografiích s
reokluzí po aortokoronárních bypassech. U pacientů s familiární hypercholesterolémií
se Lp(a) jeví jako hlavní diskriminační faktor mezi osobami s ICHS a bez
ní. Ve většině studií je Lp(a) uváděn jako prokázaný nezávislý rizikový
faktor ICHS. Současná přítomnost hypercholesterolémie a vysokých hladin
LDL cholesterolu však významně riziko ICHS zvyšují. Tak u osob
s koncentracemi Lp(a) >
500 mg/l a současně zvýšeným LDL cholesterolem je relativní riziko výskytu
časné ICHS zvýšeno na šestinásobek. Jako rizikové hladiny Lp(a) uvádí většina
autorů již hodnoty >300
mg/l, někteří autoři uvádějí však hodnoty nižší. Vysoké hladiny Lp(a) byly
popsány v několika populacích včetně naší u i ischemických cévních
mozkových příhod, stejně jako u ischemické choroby dolních končetin.
Pozor: Klinická interpretace koncentrací lipoproteinu Lp(a) je ztížena
výraznou odpovědí akutní fáze na akutní koronární ischemické syndromy i
chirurgické výkony. Lp(a) se zvyšuje jako ostatní proteiny akutní fáze po
infarktu myokardu, kdy byla pozorována až 277% elevace jeho koncentrace
v plazmě. Výkyvy koncentrace Lp(a) byly shledány i v odpovědi na
těhotenství a pokročilé nádory.
Zvýšené hladiny Lp(a) byly popsány u nefrotického syndromu, pokročilé chronické renální insuficience,
hemodialyzovaných pacientů a diabetické nefropatie.
Vysoké koncentrace Lp(a) jsou velmi špatně ovlivnitelné léčebně a
dostupná hypolipidemika s výjimkou kyseliny nikotinové a snad i
fenofibrátu jeho hladiny významně neovlivňují. Snížení následuje po aplikaci
neomycinu a při substituční hormonální léčbě žen po menopauze.
Novější
studie ukazují, že při fyziologických koncentracích může Lp(a) regulovat
fibrinolytickou aktivitu, zatímco při zvýšené koncentraci může tuto aktivitu
inhibovat soutěží s plazminogenem o vazebné místo na fibrinu. Není zatím
jisté, zda jsou zvýšené koncentrace Lp(a) významným rizikovým faktorem ICHS u
osob s normálními hladinami lipidů.
Zdroj (syntéza, příjem)
Apo(a) je syntetizován v játrech, jeho hlavní část zřejmě vzniká v krevním řečišti připojením apo(a) na LDL částice. Část apo(a) je obsažena i ve VLDL . Poslední studie ukazují, že komplex apo-B-100-apo(a) může asociovat a částicemi bohatými na triacylglyceroly, a to původu endo- i exogenního. Takto vzniklé částice bývají označovány jako “triglyceridový“ Lp(a). Mechanismus a místo degradace Lp(a) jsou dosud nejasné Některé studie ukazují na možnou úlohu LDL-receptoru v jeho metabolické dráze, jiné tvrdí, že role těchto receptorů je malá nebo nevýznamná.
Distribuce v organismu, obsah
ve tkáních
Způsob vylučování nebo
metabolismus
Biologický poločas
Kontrolní (řídící) mechanismy
Mechanismy regulující resp. faktory ovlivňující plazmatickou hladinu
Lp(a):
1. stupeň syntézy v játrech,
2. velikost alely apo(a) - nepřímo úměrně,
3. hladina jaterní apo(a) mRNA
4. faktory prostředí,
5. posttranslační a posttranskripční pochody,
6. ovlivnění genem pro receptor LDL;
7. vlivy hormonální
Plazmatická koncentrace Lp(a) podléhá komplexní regulaci a
určitá část plazmatického Lp(a) prodělává stálé změny. Plazmatické hladiny
Lp(a) výrazně (v řádu 1000) kolísají inter-individuálně, ale jen minimálně
intra-individuálně.
Hladiny Lp(a) v lidské plazmě se vyskytují v širokém koncentračním pásmu. Hladina Lp(a) podléhá velmi málo zevním vlivům (kouření, fyzická aktivita, přírůstek na váze atd.). Zvyšuje se v prvním roce života a dále stoupá u žen po menopauze, jinak však s věkem nekoreluje a není významných rozdílů v jeho koncentraci mezi oběma pohlavími. V bělošských populacích je distribuce plazmatických hladin Lp(a) výrazně posunuta doleva a většina osob má koncentrace v oblasti nízkých hodnot do 100 mg/l. Asi 5% populace má hodnoty dokonce nižší než 10 mg/l. Průměr přestavují hladiny kolem 140-150 mg/l a mediánovou hodnotu hladina kolem 80 mg/l. Koncentrace Lp(a) jsou významně vyšší u černochů, kde distribuční křivka koncentrací Lp(a) má téměř podobu Gaussovy křivky. Číňané ze Singapuru mají naopak rozložení výrazně posunuté do oblasti nízkých hodnot.
Literatura
·
M.
Gotto: Manual of Lipid Disorders, Williams &
Wilkins 1999;
·
Kol.autorů:
Lékařská chemie a biochemie, Avicenum Osveta1990;
·
D.
Voet, J. Voetová: Biochemie, Victoria Publishing1990;
·
R.
K. Murray, D.K. Granner, P. A.Mayes, V. W.Rodwell: Harperova Biochemie, H&H
Nakladatelství a vydavatelství 1998;
· J. Masopust: Klinická biochemie, požadování a hodnocení biochemických vyšetření, Karolinum Praha 1998;
Poznámky
Detekce a kvantitativní stanovení lipoproteinu Lp(a)
Lp(a) lze detekovat při určitém uspořádání běžnou elektroforézou lipoproteinů na agarose jako samostatný pás, semikvantitativně counterimunoelektroforésou nebo imunochromatograficky. Kvantitativní stanovení hladiny Lp(a) se děje imunochemickými metodami: při nedostatečné standardizaci je však velkým problémem vzájemná porovnatelnost naměřených údajů .
Při vědomí relativní stálosti plazmatických hladin Lp (a) stačí
kvantitativní vyšetření provést jedenkráte za život.
Velmi významným a charakteristickým rysem Lp(a) je jeho heterogenita.
Jedna z jeho hlavních proteinových komponent, apolipoprotein apo(a), vykazuje vůbec největší polymorfismus, jaký byl doposud
zjištěn u plazmatického proteinu lidí. Tento polymorfismus Lp(a) významně
podmiňuje i jeho kvantitativní stanovení a podílejí se na něm následující
faktory:
1. obsah a složení Lp(a) - tzv. denzitní polymorfimus: na jedné
straně lze pozorovat “lehké“ částice Lp(a), které mají zvýšený obsah
triacylglycerolů, na straně druhé pak částice, jež nesou z drtivé většiny
estery cholesterolu, a proto mají vyšší hustotu. Proto je obtížné určit přesný
denzitní limit pro Lp(a).
2. délkový polymorfismus apo(a): je podmíněn polymorfismem genu
pro apo(a), který kóduje různý počet domén, nazývaných “kringle 4“ pro
jednotlivé izoformy apo(a). Apo(a) je podle současných údajů hlavní
determinantou velikosti částic Lp(a). Délková variabilita je spojená
s počtem kringlů 4, typu 2, který se může vyskytovat v apo(a) od 3 do
42 kopií. Variace ve velikosti apo(a) ovlivňují celkovou proteinovou hmotu
Lp(a) a hustotu celé částice. Přibližná molekulová hmotnost apo(a) činí 300
-800 kD a v běžné populaci lze detekovat nejméně 34 různých izoforem
apo(a), a to jen na základě různé velikosti molekul. Tento druh polymorfismu má
patrně vliv na samotnou funkci Lp(a). Nepřímá úměra mezi velikostí apo(a) a
koncentrací Lp(a) byla již zmíněna.
3. sekvenční polymorfismus apo(a): nejnovější studie ukazují na
možné inter-individuální rozdílnosti v sekvenci aminokyselin
v kringle 4, typu 10 apo(a) (záměna aminokyselin na pozici 72 tj. Trp-Arg
a na pozici 66 tj. Met-Thr).
4. stupeň glykosylace apo(a): apo(a) obsahuje 30 hmotnostních
procent sacharidů. Je teoreticky možné, že stupeň glykosylace se může měnit
mezi jednotlivými třídami částic Lp(a). Mutace na pozici 66 Met-Thr odhaluje
nové potenciální místo glykosylace.
Hlavní zvláštnosti imunochemického stanovení:
- vysoký stupeň homologie apo(a) a plazminogenu
- výrazný polymorfismus jednotlivých izoforem apo(a) s výraznými
odchylkami co do velikosti molekuly
- distribuce apo(a) v séru mezi různě denzitními frakcemi lipoproteinů
- 93%
evropské populace představují heterozygoti s kombinací malých a velkých
izoforem
Významné problémy stanovení Lp(a) imonochemickými metodami
1. Neexistence vhodného primárního standardu: primární standard byl měl mít podobné složení jako
analyt v testovaném vzorku (Lp(a) obsahuje lipidy, proteiny,sacharidy a jeho
složení podléhá výraznému polymorfismu) V současnosti je výběr vhodných kalibračních
materiálů a jejich složení svévolným procesem. Standardizace metody -
doporučení založené na konsensu expertů: použít materiál obsahující jen jedinou
izoformu apo(a) a střední velikosti (?) nebo směs různých izoforem o
reprezentativní distribuci (?) - neexistuje standardizační protokol pro izolaci
částic Lp(a). byly zkoušeny různé techniky - všechny jsou velmi problematické.
2. Výběr vhodné protilátky:
problém specifičnosti protilátky: většina polyklonálních protilátek je namířena
proti antigenním determinantám lokalizovaným na “kringle 4“, typu 2 apo(a):
Vykazuje však tato protilátka stejnou vazebnou afinitu pro všechny izoformy
apo(a) bez ohledu na jejich velikost ? Navíc každá polyklonální protilátka
reaguje též s plazminogenem a naopak. Monoklonální protilátky zase nemusí
díky polymorfismu apo(a) rozpoznat všechny jeho izoformy a mohou vykazovat
sníženou imunoreaktivitu. Potenciálním řešením se jeví příprava protilátky
proti non-repetitivním doménám apo(a) – “kringle 5“ nebo “kringle 4“, typu 10,
či proteázové doméně.
3. Preanalytická standardizace,
interference:
Doporučuje se používat sérum z čerstvě odebrané krve, avšak někteří
výrobci nevylučují použití citrátové nebo EDTA plazmy. Doba skladování při 4oC
uváděná na komerčních kitech se značně liší: od 24 hod. do jednoho týdne. Málo
prostudovanou se jeví možnost interference a ovlivnění hladiny Lp)a) farmaky.
4. Výběr metody – nutno
zejména zohlednit citlivost metody na izoformy apo(a)
Některé imunochemické kvantifikační metody ke kvatifikaci
lipoproteinu Lp(a)
|
V: jednoduché stanovení, nevyžaduje ředění vzorků; lze použít jak
polyklonálních, tak směsi monoklonálních protilátek N: časově náročné stanovení, nepoužitelné pro velké série, s nízkou
analytickou sensitivitou a různou sensitivitou k různým velikostem částic:
nadhodnocení menších, podhodnocení větších Lp(a) částic |
|
Elektroimunodifúse (EID) V: dobrá korelace s citlivějšími technikami (jako např. ELISA), lze
použít polyklonálních protilátek, sensitivita k apo(a) polymorfismu je
neznámá N: nízká analytická sensitivita, časově náročné stanovení,
nepoužitelné pro velké série vzorků, |
|
Imunonefelometrické a imunoturbidimetrické metody (INA, ITA) V: rychlé, jednoduché, nejméně náročné pro laboratoře co do
technického vybavení, dobrá přesnost a reprodukovatelnost, lze je dobře
automatizovat, mají dobrou korelaci s RIA, IRMA, ELISA metodami, latexová
aglutinace může eliminovat nespecifickou precipitaci (INA; - ta je navíc
vysoce sensitivní k rozdílnostem spočívajícím v různé velikosti Lp(a) částic) N: nízká sensitivita (vysoký stupeň šumu), různé sérové matrice mohou
stanovení různě nespecificky ovlivnit, |
|
Radioimunoassay a imunoradiometrické metody ( RIA, IRMA) V: vysoce sensitivní, lehce automatizovatelné s dobrou přesností a
reprodukovatelností N: vyžadují příslušný měřící přístroj, užití radioisotopů,
s omezenou dobou použití, měření v duplikátu (triplikátu) |
|
Enzyme-liked imunosorbent assay (ELISA) V: dosud nejpoužívanější technika stanovení Lp(a), nejčastěji na
“sandwichová“, se stejnými výhodami jako RIA N: výsledek závisí na detekčním záchytném systému |
Při
imunochemickém stanovení koncentrace lipoproteinu Lp(a) lze narazit na řadu
problémů. Jde zvláště o problémy kalibrace, výběru vhodné protilátky a metody,
která by neměla být závislá na polymorfismu apolipoproteinu(a). Při zavádění
metody na stanovení Lp(a) je nezbytné určení vlastního referenčního intervalu.
Z mnoha důvodů nelze používat cut-off hod-notu 300 mg/l jako hodnotu
universální (interval 110-323 mg/l).
Appendixy
Autorské poznámky
recenzoval Jan Buryška