OSN-SAbstraktOSN-E

Imunoturbidimetrická analýza je založena na měření množství imunitních komplexů vytvořených interakcí specifických protilátek s antigenem - analytem.

 

 

OSN-SSouvisející informaceOSN-E

Imunochemické techniky

 

OSN-STextOSN-E

Smísí-li se rozpustný antigen ve vhodném poměru s odpovídající protilátkou, vytvoří se precipitát. Kvantitativně byla tato reakce popsána již v r. 1929 Heidelbergem a Kendallem. Precipitační křivka je znázorněna na obr. 1.

 

Obr. 1: Precipitační křivka podle Heidelbergera a Kendalla

Ab Excees zone – oblast nadbytku protilátky

 

Equivalence zone – oblast ekvivalence antigenu a protilátky

 

Ag Excess zone – oblast nadbytku antigenu

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

V oblasti nadbytku protilátky vzrůstá množství precipitátu s přídavkem antigenu. V oblasti ekvivalence je množství precipitátu největší a v oblasti nadbytku antigenu se tvoří jen malé imunokomplexy, které neprecipitují. Z analytického hlediska můžeme precipitační křivku rozdělit na oblast využitelnou pro měření, bezpečnostní oblast a na oblast za kritickým bodem. Tento kritický bod, který představuje nejvyšší koncentraci antigenu, který může analyzovaný vzorek obsahovat, aniž bychom naměřili falešně nízké koncentrace antigenu, by měl být znám u každé prováděné techniky v daném analytickém systému (obr.2).

K měření množství vytvořených imunitních komplexů je možno použít turbidimetrie, která je založena na skutečnosti, že po průchodu světelného paprsku  suspensí imunitních komplexů dochází k poklesu jeho intensity v důsledku roztylu, absoprce a odrazu. Matematický popis zákalu (turbidity) - T - lze vyjádřit rovnicí:

 

                                                                   T=   (1/b).ln(Io/I),

 

kde  b je tlouštka kyvety, Io počáteční intensita světelného paprsku, I intensita paprsku po průchodu suspensí částic (imunitních komplexů).  Pokles intensity paprsku je  úměrný množství imunitních komplexů v roztoku. Rychlost tvorby imunitních komplexů je zvýšena přítomností ve vodě rozpustných lineárních polymerů (např. polyethylenglykol 6000), které vedle zvýšení rychlosti interakce specifických protilátek s analytem a také suspensi imunitních komplexů v roztoku stabilizují. Při konstantní vysoké koncentraci specifických protilátek,  je množství vytvořených imunitních komplexů (turbidita analyzovaného vzorku tělní tekutiny) přímo úměrné koncentraci analytu.  Pracovní koncentrační rozmezí, pro které platí tato závislost je ohraničené nejvyšší koncentrací kalibrátoru,  vzorky obsahující vyšší koncetrace analytu je třeba retestovat po vhodném naředění (viz výše, obr.2).

Kromě turbidimetrie, kde měříme zeslabení intenzity paprsku procházejícího světla zakaleným vzorkem, je možno měřit velikost zákalu způsobeného imunokomplexy i pomocí nefelometrie, kde je měřeno světlo rozptýlené na precipitátu. Úhel rozptylu je dán velikostí částic a vlnovou délkou dopadajícího světla. Princip turbidimetrie a nefelometrie je znázorněn na obr. 3.

 

 

Obr.2: Křivky závislosti signálu na koncentraci antigenu a protilátky

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1 – nízká, 2 – střední, 3 – vysoká koncentrace protilátky

 

Obr. 3: Princip nefelometrie a turbidimetrie

 

a: vstupující světlo, b: štěrbina, c: reakční kyveta, d: fotodetektory, e: zařízení pro pohlcení světla

 

OSN-SLiteraturaOSN-E

  1. Svendsen P.J., Blirup-Jensen S.: Determination of Human Plasma Proteins by Turbidimetry and Nephelometry, 2nd edition, DAKO A/S, Copenhagen, 1977

 

OSN-SAutorské poznámkyOSN-E

Laďka  Rozprimová