OSN-SAbstraktOSN-E

Metoda otisků (z angl. blotting) je analytická metoda, která umožňuje přenos molekul z mobilní fáze (např. agarózový nebo polyakrylamidový gel, ale také běžný roztok) do pevné fáze, na kterou jsou fixovány.

OSN-SSouvisející informaceOSN-E

Imunochemické techniky

OSN-STextOSN-E

Metoda otisků (z angl. blotting) je analytická metoda, která umožňuje přenos molekul z mobilní fáze (např. agarózový nebo polyakrylamidový gel, ale také běžný roztok) do pevné fáze, na kterou jsou fixovány. Tuto pevnou fázi může představovat např. nitrocelulózá membrána. Přenos se může uskutečnit běžnou difúzí přiložením membrány na gel, což připomíná odsávání skvrn pomocí savého papíru a odtud také název blotting, pomocí jednosměrného proudu (electroblotting) nebo filtrací roztoku přes membránu (dot blotting) pomocí speciálních zařízení. Molekuly přenesené a fixované na pevné fázi se zviditelňují přímo po fixaci různými barevnými reakcemi nebo autoradiografií nebo až po reakci se specifickými protilátkami (immunoblotting).

Otiskové metody se používají především pro přenos molekul DNA, RNA, proteinů a glykoproteinů po jejich předcházející separaci elektroforézou nebo izoelektrickou fokusací na gelových nosičích a umožňují tak průkaz několika specifických antigenů v jednom vzorku najednou (jakousi fenotypizaci vzorku a tím i jedince, od kterého byl získán). Na druhé straně nacházejí stále více uplatnění imunodotovací techniky (DIBA – dot immunobindig assay), kdy jsou na membránách imobilizovány čisté antigeny, které pak mohou sloužit ke screeningovému průkazu protilátek v analyzovaných vzorcích. Tyto techniky našly uplatnění např. v diagnostice spec. IgE, autoprotilátek, infekční sérologii apod. Na membrány mohou však být navázány také specifické protilátky, které pak slouží naopak k průkazu antigenů v analyzovaných vzorcích. Výhodou těchto technik je jejich jednoduchost, dobrá reprodukovatelnost, malá spotřeba vzorku a poměrně vysoká citlivost. Např. dolní hranice stanovitelnosti imunoglobulinů pomocí těchto technik je 1-5 ng. Význam DIBA vzrůstá v poslední době také s rozvojem techniky biočipů, která umožňuje současnou detekci a semikvantifikaci desítek analytů v mikrolitrových objemech jednoho vzorku.

Přenos fragmentů DNA z agarózového gelu na nitrocelulózovou membránu popsal poprvé roku 1975 E.M.Southern. Odtud dostala tato technika název southern blotting. V r. 1977 tuto metodu vylepšili použitím diazobenzylmethylovaného papíru J.C.Alvine a kol. Tato varianta dostala název northern blotting. R. 1979 J. Renart a kol. a H. Towbin a kol. obě metody adaptovali na analýzu proteinů (immunoblotting). R. 1981 W.N.Burnette použil na detekci imunobilzovaných antigenů specifické protilátky a radioaktivně značený protein A ve funkci druhého ligandu. Tato metoda dostala název western blotting, přestože jako předchozí varianty nemá se zeměpisnými stranami co do činění.

Otiskové metody mají tyto kroky:

1. Zkoumaná směs antigenů se rozdělí pomocí jednorozměrné nebo dvourozměrné elektroforézy nebo izoelektrickou fokusací na agarózovém nebo polyakrylamidovém gelu nebo se purifikované antigeny nebo protilátky naředí na vhodnou koncentraci ve vhodném pufru.

2. Pomocí vhodné blotovací aparatury se přenesou antigeny z gelu na vhodnou membránu (matrici).

3. Po imobilizací antigenů na membránu se membrána opracuje blokujícím agens, čímž se vysytí (zablokují) nespecifická vazebná místa, aby v následných krocích nedocházelo k nespecifickým interakcím mezi detekční sondou a matricí. Detekčními sondami mohou být protilátky, specifické vazebné proteiny nebo jiné ligandy. Při nespecifické vazbě detekčních sond s matricí vzniká silné pozadí, které znesnadňuje nebo dokonce znemožňuje vyhodnocení analýzy. V případě imobilizace DNA nebo RNA může být provedena před vlastní detekcí amplifikace specifických úseků těchto nukleových kyselin pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR – polymerase chain reaction). V případě imobilizace RNA musí být samozřejmě provedena nejprve reversní transkripce RNA na cDNA. Tato PCR in situ výrazně zvyšuje citlivost metody.

4. Posledním krokem je vizualizace použitím detekční sondy (např. autoradiograficky, barevnou reakcí, fluorescenčně apod.), která může mít také několik kroků.

OSN-SLiteraturaOSN-E

1. Ferenčík M.: Imunochémia, Alfa, Bratislava, 1989, str. 404 – 410

OSN-SAutorské poznámkyOSN-E

Ivo Lochman