Abstrakt
Analytická metoda, která pomocí imunochemické reakce s
enzymatickou detekcí umožňuje stanovit v neznámém vzorku koncentraci analytu. Je
speciálním případem EIA. Indikátor imunochemické reakce je označen enzymem s
vysokým číslem přeměny.
Související informace
Text
ELISA má heterogenní povahu, vyžaduje separaci volné a
vázané frakce indikátoru. ELISA může být kompetitivní a nekompetitivní.
HETEROGENNÍ
Kompetitivní -se značeným antigenem
-se značenou
protilátkou
Nekompetitivní -se značenou protilátkou
Indikátorem imunoanalytické metody je enzymový konjugát.
Podle povahy substrátu je reakci možno detekovat spektrofotometricky, nefelometricky,
fluorometricky, luminometricky.
-
Heterogenní kompetitivní se značeným antigenem
Soutěživá reakce mezi analytem a analytem označeným
enzymem (konjugátem) o vazebná místa na protilátce (analogie s RIA). Po separaci volné a na
protilátku vázané frakce proběhne detekční enzymatická reakce. Změřením
koncentrace vzniklého produktu (nebo úbytku substrátu) lze stanovit hladinu analytu. Kalibrační
závislost je nelineární (ke kalibraci je třeba použít dostatečný počet kalibračních bodů),
odezvový signál může být přímo, ale také nepřímo úměrný koncentraci analytu (záleží na tom, zda se měří
volná nebo vázaná frakce a rovněž záleží na povaze substrátu - s úbytkem
substrátu absorbance klesá nebo stoupá).
-
Heterogenní kompetitivní se
značenou protilátkou
V tomto případě musí být antigen navázán na pevnou fázi.
Při kompetitivní reakci s antigenem v
neznámém vzorku se ustaví rovnováha. Nenavázaný konjugát je odstraněn z reakční směsi
promytím a konjugát vázaný na pevné fázi je inkubován s enzymovým substrátem. Je
možné měřit i volnou frakci nenavázaného konjugátu. Kalibrace je nelineární,
její charakter závisí na zvoleném typu reakce a charakteru substrátu. Detekce může být fotometrická,
fluorometrická i luminometrická podle typu substrátu.
-
Heterogenní nekompetitivní
enzymoimunoanalýza
Obvykle se používá dvojice protilátek proti dvěma různým
antigenním determinantám analytu (analogie IRMA). Na jednu z protilátek je kovalentně
navázán enzym. Druhá protilátka bývá navázána na pevnou fázi. Po ustavení
rovnováhy se vytváří "sandwich" a následuje odstranění nenavázaného konjugátu. Po
přidání substrátu je výsledný produkt kvantifikován. Kalibrace je nelineární v (nutno použít dostatečný počet kalibračních
bodů). Podle toho, kterou frakci konjugátu použijeme k měření a o jaký substrát se jedná, je
koncentrace analytu přímo nebo nepřímo úměrná odezvovému signálu (fotometrie, luminometrie,
fluorometrie). Metoda není sice univerzálně použitelná (vyžaduje analyt minimálně se
dvěma odlišnými antigenními determinantami), ale už z teoretického principu je
citlivější a specifičtější než metody kompetitivní.
Poznámky
ELISA (enzyme-linked imunosorbent assay) je speciálním
druhem EIA (heterogenní nekompetitivní nebo nekompetitivní EIA). Další nepřesností je řazení
některých EIA mezi FIA a LIA, i když indikátorem je enzym a k detekci se
používá fluorogenní substrát nebo substrát vykazující
luminiscenci.
Appendixy
V imunoanalýze byly enzymy poprvé aplikovány v roce 1971
Engvalem, Perlmannem, Van Weemanem a Schuursem.
Literatura
B. Rothfeld: Nuclear Medicine in vitro. Lippicott Co.
1983
Zichová, Hušák, Šafarčík: Vyšetřovací metody in vitro v
nukleární medicíně. IPVZ Brno, 1993
Autorské poznámky
Autor: Šafarčík Kristian
Datum
aktualizace: 26. 11. 1998