Abstrakt
Hybridizace
fragmentů DNA s jinou molekulou DNA - komplementární a
značenou sondou se provádí na pevných nosičích, na kterých je polynukleotid
vázán a je současně schopen hybridizace. Mezi varianty hybridizace na pevném nosiči patří dot-, blot- a slot-
hybridizace, Southernův přenos, hybridizace RNA
(northern blotting) a hybridizace
in situ. Imobilizace vzorků se provádí nejčastěji na membrány z nitrátu
celulózy nebo nylonu. Přenosu DNA na pevný nosič předchází depurinace,
alkalická denaturace a neutralizace. Přenos se uskuteční buď prostou difúzí na
podkladě kapilárních sil, za pomoci vakua nebo působením elektrického proudu
(electroblotting). Vlastní hybridizace znamená reasociaci příslušných dvojic
bazí podle specifického pořadí nukleotidů se sondou značenou
radioaktivním nebo neradioaktivním markerem. Při metodě hybridizace in situ hybridizace
probíhá v morfologicky intaktní tkáni, v buňkách nebo na chromosomech, které
jsou fixovány na mikroskopickém sklíčku. Demonstruje se genetická informace v
morfologickém kontextu a metoda sdružuje standardní světelnou mikroskopii s
detekcí hybridizace. Hybridizaci se značenou sondou může předcházet
amplifikační reakce (nepřímá in situ PCR). Přímá in situ PCR inkorporuje
marker vázaný na oligonukleotidový primer nebo na dNTP přímo. Následuje obvykle
detekce protilátkou a vizualizace. Celý proces může být automatizován.
Příkladem je metoda FISH (fluorescenční
in situ hybridizace). Velmi speciální metodou je analogicky přímá a nepřímá in
situ RT PCR (reverzní
transkripce a amplifikace cDNA), která využívá vlastností rekombinantní rTth
DNA polymerázy.
Autorské poznámky
Jaroslava Vávrová