Abstrakt
Analytická metoda, která pomocí imunochemické reakce s
fluorescenčním indikátorem umožňuje stanovit v neznámém vzorku koncentraci analytu. Je
analogií enzymoimunoanalýzy (EIA), kde enzym je nahrazen fluorescenční sondou. Detekční
technikou je fluorometrie.
Související informace
Text
FIA lze rozdělit na základě principu imunochemické
reakce na kompetitivní a nekompetitivní. Vazbou protilátky na antigen značený fluorescenční sondou
může dojít ke změně některé z charakteristik fluorescenčního záření a tím jsou
možné i homogenní fluoroimunoanalýzy, bez nutnosti separace volné a vázané frakce
antigenu značeného fluorescenční sondou. Heterogenní techniky separační krok vyžadují.
Schéma a rozdělení FIA je analogické enzymoimunoanalýzám (EIA).
Požadavky na fluorescenční indikátor:
-vysoká
molární absorbance
-vysoký
kvantový výtěžek
-velký
Stokesův posun
Měření fluorescence je silně ovlivňováno prostředím, ve
kterém je fluorescenční látka měřena. Silně interferují zejména některé biologické látky v
séru. Principiálně je měření fluorescence citlivější než měření radioaktivity.
K dosažení teoretické citlivosti měření bylo v imunoanalýze zavedeno několik
speciálních technik. Časově modulovaná detekce fluorescence (time-resolved fluorescence
measurement) využívá chelátů vzácných zemin (Eu, Tb, Sm). Fluorescenční sonda je tvořena nejprve stabilním chelátem iontu
vzácné zeminy konjugovaným s protilátkou nebo antigenem. Po proběhlé imunochemické reakci se
tento chelát přemění na vysoce fluoreskující sloučeninu. Tyto sloučeniny mají dlouhodobou fluorescenci
(řádově stovky mikrosekund) s velkým Stokesovým posunem fluorescenčního spektra
(rozdíl mezi vlnovou délkou excitačního a fluorescenčního spektra). Vzorek je pulsně excitován
určitou vlnovou délkou světelného záření xenonovou výbojkou nebo laserem
(frekvence 1 milisekunda). Detekce fluorescenčního záření je zaznamenávána se
zpožděním několika desítek mikrosekund po dobu několika stovek mikrosekund. Takto se
neregistruje parazitní fluorescenční záření biologického materiálu, jehož doba fluorescence se pohybuje v
nanosekundách. Cyklus se opakuje 1000krát za sekundu. Fluorescence je změřena v
kalibrátorech (5 až 8) a ve vzorcích. Pomocí kalibrační křivky je možno v jednotlivých
vzorcích stanovit koncentrace stanovované látky.
Homogenní FIA je možno uvést na příkladu FPIA - Fluorescence
Polarization Immunoassay. Tato kvantitativní analytická metoda využívá kombinace dvou
principů - kompetitivní imunochemické reakce mezi stanovovaným analytem a vhodným indikátorem o vazebná místa na specifické protilátce a měření vertikálně polarizovaného
fluorescenčního záření emitovaného po excitaci vzorku rovněž polarizovaným
světlem. Tato technologie je použitelná pro určení koncentrace malých molekul. Ty
se v roztoku otáčejí velkou rychlostí. Pokud je molekula označena vhodnou fluorescenční látkou
(fluoresceinem) a je excitována polarizovaným světlem vhodné vlnové délky, emituje fluorescenční
záření do mnoha směrů. Detekce ve stejné polarizované rovině naměří jen malou
část fluorescence.
Pokud tato malá molekula obsadí vazebné místo na protilátce, dojde k vytvoření
komplexu (velké molekuly), která se otáčí pomalu, což má za následek zvýšení
fluorescence detekované v polarizované rovině. V kompetitivním uspořádání metoda poskytuje
možnost stanovit koncentrace analytu bez nutnosti separace volné a vázané
frakce fluorogenního indikátoru. Postup je využíván v přístrojích TDx, IMx nebo AXSYM
firmy Abbott. Nejprve se provede analýza kalibrátorů (6 ks). Kalibrační křivka je uložena v
paměti přístroje a používá se pro vyhodnocení koncentrací sledované látky delší
dobu.
Poznámky
Appendixy
Literatura
DELFIA - Pharmacia LKB, Technical Information
IMx System Operation Manual, Abbott Diagnostics
Autorské poznámky
Autor: Šafarčík Kristian
Datum
aktualizace: 26. 11. 1998