Abstrakt
FPIA - Fluorescence Polarization Immunoassay je
kvantitativní analytická metoda využívající kombinaci dvou principů: -
kompetitivní imunochemická reakce mezi stanovovaným analytem a analytem značeným
indikátorem (fluoresceinem) o vazebná místa na specifické protilátce, - měření
vertikálně polarizovaného fluorescenčního záření emitovaného na základě
excitace rovněž polarizovaným světlem. Reakce probíhá v homogenním uspořádání
bez nutnosti separačního kroku. Postup je využíván v systémech TDx, IMx nebo
AxSYM firmy Abbott.
Související informace
Text
Technologie je použitelná pro určení koncentrace malých
molekul. Ty se v roztoku otáčejí relativně velkou rychlostí. Pokud je tato
molekula označena vhodnou fluorescenční značkou (fluorescein) a je excitována polarizovaným světlem vhodné
vlnové délky, emituje fluorescenční záření do mnoha směrů. V případě jeho
detekce rovněž v polarizované vertikální rovině je naměřena pouze jeho malá
část. Pokud však tato malá molekula obsadí vazebné místo specifické protilátky,
dojde díky vytvoření komplexu s velkou molekulou k výraznému snížení rychlosti
jeho rotace v roztoku, což má za následek zvýšení detekované polarizované
fluorescence. Díky vhodnému uspořádání je možné vynechání obvykle potřebného
separačního kroku k oddělení tzv. volné a vázané frakce indikátoru analytické reakce. V případě velkého obsahu
analytu ve sledovaném vzorku dojde během kompetitivní reakce k jeho přednostní
vazbě na vazebná místa specifické protilátky, v roztoku zůstane především
nenavázaný indikátor a v důsledku toho je naměřena malá polarizovaná
fluorescence. Naopak při nulové koncentraci analytu ve vzorku je změřena
maximální hodnota polarizované fluorescence. Jinými slovy to znamená, že
hodnota naměřené odezvy je nepřímo úměrná koncentraci analytu ve vzorku.
Poznámky
Pro kvantitativní stanovení je zapotřebí nejprve provést
analýzu kalibrátorů (obvykle 6 hladin). Kalibrační křivka je uložena v paměti
přístroje a je použitelná poměrně dlouhou dobu.
Vlnová délka vertikálně polarizovaného excitačního
záření je 485 nm, emitované fluorescenční záření má vlnovou délku v rozsahu 525
- 550 nm.
Appendixy
Literatura
IMx System Operation Manual, Abbott Diagnostics
Autorské poznámky
Autor: Bartoš Vladimír
Datum
aktualizace: 26. 11. 1998