OSN-SAbstraktOSN-E

Analytická metoda, která pomocí imunochemické reakce s fluorescenčním indikátorem umožňuje stanovit v neznámém vzorku koncentraci analytu. Je analogií enzymoimunoanalýzy (EIA), kde enzym je nahrazen fluorescenční sondou. Detekční technikou je fluorometrie.

 

OSN-SSouvisející informaceOSN-E

EIA RIA IRMA FPIA

 

OSN-STextOSN-E

FIA lze rozdělit na základě principu imunochemické reakce na kompetitivní a nekompetitivní. Vazbou protilátky na antigen značený fluorescenční sondou může dojít ke změně některé z charakteristik fluorescenčního záření a tím jsou možné i homogenní fluoroimunoanalýzy, bez nutnosti separace volné a vázané frakce antigenu značeného fluorescenční sondou. Heterogenní techniky separační krok vyžadují. Schéma a rozdělení FIA je analogické enzymoimunoanalýzám (EIA).

 

Požadavky na fluorescenční indikátor:

 -vysoká molární absorbance

 -vysoký kvantový výtěžek

 -velký Stokesův posun

 

Měření fluorescence je silně ovlivňováno prostředím, ve kterém je fluorescenční látka měřena. Silně interferují zejména některé biologické látky v séru. Principiálně je měření fluorescence citlivější než měření radioaktivity. K dosažení teoretické citlivosti měření bylo v imunoanalýze zavedeno několik speciálních technik. Časově modulovaná detekce fluorescence (time-resolved fluorescence measurement) využívá chelátů vzácných zemin (Eu, Tb, Sm).  Fluorescenční sonda je tvořena nejprve stabilním chelátem iontu vzácné zeminy konjugovaným s protilátkou nebo antigenem. Po proběhlé imunochemické reakci se tento chelát přemění na vysoce fluoreskující sloučeninu. Tyto sloučeniny mají dlouhodobou fluorescenci (řádově stovky mikrosekund) s velkým Stokesovým posunem fluorescenčního spektra (rozdíl mezi vlnovou délkou excitačního a fluorescenčního spektra). Vzorek je pulsně excitován určitou vlnovou délkou světelného záření xenonovou výbojkou nebo laserem (frekvence 1 milisekunda). Detekce fluorescenčního záření je zaznamenávána se zpožděním několika desítek mikrosekund po dobu několika stovek mikrosekund. Takto se neregistruje parazitní fluorescenční záření biologického materiálu, jehož doba fluorescence se pohybuje v nanosekundách. Cyklus se opakuje 1000krát za sekundu. Fluorescence je změřena v kalibrátorech (5 až 8) a ve vzorcích. Pomocí kalibrační křivky je možno v jednotlivých vzorcích stanovit koncentrace stanovované látky.

 

Homogenní FIA je možno uvést na příkladu FPIA - Fluorescence Polarization Immunoassay. Tato kvantitativní analytická metoda využívá kombinace dvou principů - kompetitivní imunochemické reakce mezi stanovovaným analytem a  vhodným indikátorem o vazebná místa na specifické protilátce a měření vertikálně polarizovaného fluorescenčního záření emitovaného po excitaci vzorku rovněž polarizovaným světlem. Tato technologie je použitelná pro určení koncentrace malých molekul. Ty se v roztoku otáčejí velkou rychlostí. Pokud je molekula označena vhodnou fluorescenční látkou (fluoresceinem) a je excitována polarizovaným světlem vhodné vlnové délky, emituje fluorescenční záření do mnoha směrů. Detekce ve stejné polarizované rovině naměří jen malou část fluorescence. Pokud tato malá molekula obsadí vazebné místo na protilátce, dojde k vytvoření komplexu (velké molekuly), která se otáčí pomalu, což má za následek zvýšení fluorescence detekované v polarizované rovině. V kompetitivním uspořádání metoda poskytuje možnost stanovit koncentrace analytu bez nutnosti separace volné a vázané frakce fluorogenního indikátoru. Postup je využíván v přístrojích TDx, IMx nebo AXSYM firmy Abbott. Nejprve se provede analýza kalibrátorů (6 ks). Kalibrační křivka je uložena v paměti přístroje a používá se pro vyhodnocení koncentrací sledované látky delší dobu.

 

OSN-SPoznámkyOSN-E

 

OSN-SAppendixyOSN-E

 

OSN-SLiteraturaOSN-E

DELFIA - Pharmacia LKB, Technical Information

IMx System Operation Manual, Abbott Diagnostics

 

OSN-SAutorské poznámkyOSN-E

Autor: Šafarčík Kristian  

Datum aktualizace: 26. 11. 1998