Abstrakt
Fluorescence je druh
luminiscence, u níž dochází k emisi světla v čase kratším než 10-8
s. Jedná se o emisi elektromagnetického záření při přechodu mezi dvěma stavy
téže multiplicity (obvykle dvěma singlety). Molekuly absorbují světlo při jedné
vlnové délce (excitační) a reemitují při větší vlnové délce (emisní).
Související informace
Text
Text je členěn dle
osnovy:
1.Luminiscence
2.Druhy luminiscence
2.-
A. Fluorescence
2.-
B. Fosforescence
2.-
C. Chemiluminiscence
Elektrochemiluminiscence
3.Fluorimetrie
3.-
A. Fluorescenční polarizace
3.-
B. Vztah koncentrace k intenzitě fluorescenční emise
3.-
C. Omezení fluorescenčních měření
3.-
C.-1 Vnitřní efekt filtru
3.-
C.-2 Efekty pozadí
4.Měření fluorescence -
instrumentace
1. Luminiscence
je emise světla při návratu
elektronu z excitovaného stavu nebo vyšší energetické hladiny na nižší
energetickou úroveň
2. Druhy luminiscence:
- fluorescence
- fosforescence
- chemiluminiscence
vzájemně se liší:
–
aktivací elektronu do
excitovaného stavu
–
způsobem vyzáření energie
· kvantum světelné energie pohlcené molekulou způsobí
přemístění elektronu ze základního singletového stavu do jedné z možných
excitovaných posic (singletových nebo výše tripletových)
· je-li molekula v excitovaném stavu, je několik
cest návratu k původnímu energetickému stavu:
singlet excitovaný ®
singlet ustálený (fluorescence 10-8
s)
triplet excitovaný ® singlet ustálený (fosforescence 10-4 s -
100 s)
2.- A. Fluorescence
· druh luminiscence, u níž dochází k emisi
světla v čase kratším než 10-8 s
· je emise elektromagnetického záření při přechodu mezi
dvěma stavy téže multiplicity (obvykle dvěma singlety)
· molekuly absorbují světlo při jedné vlnové délce
(excitační) a reemitují při větší vlnové délce (emisní)
· klasické fluorofory: fluorescein, rhodamin, methylumbelliferon
2.- B. Fosforescence
· emise záření při přechodu mezi dvěma stavy rozdílné
multiplicity (triplet - singlet)
2.- C. Chemiluminiscence
· vzniká vyzářením fotonu z molekuly luminoforu po
jeho chemické oxidaci
· světlo emitované vzniká oxidační reakcí organických
sloučenin (luminol, isoluminol, luciferin) působením oxidantů (H2O2
, O2 , ClO4- )
· bioluminiscence: zvláštní forma chemiluminiscence -
např. enzymy luciferáza, alkalická fosfatáza zvyšují efekt luminiscenční reakce
· je modifikace chemiluminiscence, kdy světlo je
generováno sérií chemických reakcí iniciovaných elektrochemicky:
- na elektrodě je dvojmocná sůl ruthenia oxidována na
trojmocnou, zároveň je tripropylamin (TPA+) oxidován na radikál TPA+
, tento radikál má redukční vlastnosti, proto snadno redukuje trojmocný
rutheniový komplex na dvojmocný, velký rozdíl potenciálů způsobí, že elektron
z TPA přeskočí do vyšší energetické hladiny rutheniového kationtu,
přechodem tohoto elektronu do základního stavu se vyzáří foton (luminiscence)
a rutheniový komplex je opět schopen další oxidace
· rutheniový kation prochází reakcí cyklicky,
nespotřebovává se, chová se jako enzym
· TPA se rozpadá na dipropylamin, je v reakci
spotřebováván, slouží jako substrát
3. Fluorimetrie
3.-
A. Fluorescenční polarizace
·
světlo je tvořeno
elektrickými a magnetickými vlnami vzájemně kolmými
· polarizované světelné vlny mají vektory elektrického
pole orientovány v jedné rovině
· využívá se změn fluorescenční polarizace např. v průběhu imunologických reakcí, aplikovatelná na
homogenní reakce nízkomolekulárních analytů (např. léky)
|
Fluorimetrie -
polarizační analyzátor · vzorek je excitován polarizovaným světlem (získá se
max. citlivost), analyzátor polarizovaného světla je nastaven k měření
intenzity emitované fluorescence světla ve vertikální ploše, pak se
polarizační analyzátor otočí o 90o a měří se emitované záření v
horizontální rovině |
3.-
B. Vztah koncentrace k intenzitě fluorescenční emise
·
intenzita fluorescence
je úměrná koncentraci fluoroforu a excitační intenzitě
·
vztah platí pro zředěné
roztoky, kde je absorbance < 2 % excitovaného
záření
·
při absorbanci > 2 % je závislost
nelineární, je způsobena tzv. “vnitřním filtrovým efektem”
·
další faktory
ovlivňující měření intenzity fluorescence:
a) citlivost detektoru
b) stupeň rozptylu
světla před detekcí (ztráty, pozadí)
3.-
C. Omezení fluorescenčních měření
Fluorescenční měření
·
řádově citlivější než
měření absorbance (100 - 1000´),
·
absorbance
v roztoku je určena koncentrací a dráhou světla,
·
fluorescence je určena
koncentrací, dráhou světla a intenzitou světelného zdroje
Omezení
fluorescenčních měření:
·
koncentrační efekty
(vnitřní filtrový efekt, koncentrační zhášení)
·
efekty pozadí (Rayleighův rozptyl, Ramanův rozptyl)
·
vliv rozpouštědel (
interferující nespecif. fluorescence a zhášení z rozpouštědla)
·
vzorkové efekty
(zhášení světla, interferující fluorescence, adsorpce)
·
teplotní efekty
·
fotodekompozice vzorku
3.-
C.- 1. Vnitřní (skrytý) efekt filtru
Je-li absorbance roztoku > 2 % excitovaného světla, pak může mít fluorescence
nelineární průběh, v extrémním případě může být intenzita fluorescenční emise z
velmi koncentrovaných roztoků menší
než emitovaná intenzita zředěných roztoků téhož fluoroforu.
Vnitřní
filtrový efekt - excitované světlo
je absorbováno samotným fluoroforem.
Eliminace:
Koncentrační
zhášení
Makromolekula (protilátka)
značená fluoroforem - při excitaci může být fluorescenční značení prostorově
uzavřeno, proto dojde ke sníženému přenosu budící energie (problém průtokové
cytometrie, LIF).
3.-
C.- 2. Efekty pozadí
Světlo je absorbováno molekulami
při všech vlnových délkách a emitováno bez ztráty energie
(změna vibrační energie, zachováni energetických hladin)
Rayleighův
rozptyl - nemění se vlnová délka
·
použití dobře
definovaných excitačních a emisních interferenčních filtrů
·
použití polarizátorů
Ramanův
rozptyl - změna vlnové délky
Následkem nepružných kolizí
se energie mění (př. při excitaci se energie sníží, rozptyl světla probíhá při
větší vlnové délce)
·
ovlivnění optikou ( za
cenu snížení citlivosti)
·
volba vlnových délek (lem, lex) mimo
oblast vzniku rozptylu
4.
Měření fluorescence - instrumentace
Základní
části fluorimetru:
·
xenonový zdroj
·
zdroj napětí
·
monochromátor
excitačního záření
·
kyveta (průtoková cela)
se vzorkem
·
monochromátor
emitovaného záření
·
detektory
·
zesilovače
· malá část paprsku (10%) je srovnávací (přes
fotonásobič)
· emisní optika je vždy kolmá na excitační
·
používá se pro
koncentrační měření předem definovaných podmínek (fixní vlnová délka
excitačního záření, fixní vlnová délka emitovaného záření)
Excitační
zdroj (abs.spektra fluoreskujících
látek - 300 - 550 nm)
· xenonová lampa zajišťující kontinuum energie pro
250-800 nm, záblesková - 2500 pulsů/sec., 200-1100 nm
· křemenná halogenová lampa
· rtuťová lampa
·
laserový zdroj
Monochromátory
·
interferenční filtry
(většinou)
·
barevné skleněné filtry
·
mřížky
(spektrofluorimetr)
·
hranoly
Vzorková
cela
·
pravoúhlé umístění
vzorku v geometrii přístroje (paprsek emitovaného záření se snímá kolmo na paprsek
excitačního záření) minimalizuje vliv pozadí ·
materiál - hlavně
křemen |
|
Detektory
fotonásobiče
Automatizované
fluoro- a spektrofluorometry
·
imunoanalyzátory
·
fluorescenční
polarizované systémy (TDx , IMx , Stratus)
·
časově rozlišující (DELFIA - imunoreagencie značeny europiem)
Fluorometry
pro speciální aplikace
·
hematofluorometry
·
laserem
indukovaná fluorimetrie
·
průtoková cytometrie
Autorské poznámky