Abstrakt
Analytická metoda, která pomocí imunochemické reakce s
enzymatickou detekcí umožňuje stanovit v neznámém vzorku koncentraci analytu.
Je analogií radioisaturační analýzy (RSA), kde radioizotop je nahrazen enzymem
s vysokým číslem přeměny.
Související informace
Text
EIA lze rozdělit na heterogenní (vyžadující separaci
volné a vázané frakce analytu) a homogenní (nevyžadující tuto separaci).
Heterogenní EIA mohou být kompetitivní a nekompetitivní
HETEROGENNÍ HOMOGENNÍ
Kompetitivní -pro stanovení malých molekul
-se značeným antigenem -pro
stanovení makromolekul
-se značenou protilátkou
Nekompetitivní
-se značenou protilátkou
Indikátorem imunoanalytické metody je enzymový konjugát.
Podle povahy substrátu je reakci možno detekovat spektrofotometricky,
nefelometricky, fluorometricky, luminometricky.
-
Heterogenní kompetitivní se značeným antigenem
Soutěživá reakce
mezi analytem a analytem označeným enzymem (konjugátem) o vazebná místa na
protilátce (analogie s RIA). Po separaci volné a na protilátku vázané frakce
proběhne detekční enzymatická reakce. Změřením koncentrace vzniklého produktu
(nebo úbytku substrátu) lze stanovit hladinu analytu. Kalibrační závislost je
nelineární (ke kalibraci je třeba použít dostatečný počet kalibračních bodů).
Odezvový signál může být přímo, ale také nepřímo úměrný koncentraci analytu
(záleží na tom, zda se měří volná nebo vázaná frakce a rovněž záleží na povaze
substrátu).
-
Heterogenní kompetitivní se značenou protilátkou
V tomto případě
musí být antigen navázán na pevnou fázi. Při
kompetitivní reakci s antigenem v neznámém vzorku se ustaví rovnováha.
Nenavázaný konjugát je odstraněn z reakční směsi promytím a konjugát vázaný na
pevné fázi je inkubován s enzymovým substrátem. Je možné měřit i volnou frakci
nenavázaného konjugátu. Kalibrace je nelineární, její charakter závisí na
zvoleném typu reakce a charakteru substrátu. Detekce může být fotometrická,
fluorometrická i luminometrická podle typu substrátu.
-
Heterogenní nekompetitivní enzymoimunoanalýza
Obvykle se
používá dvojice protilátek proti dvěma různým antigenním determinantám analytu (analogie
IRMA). Na jednu z protilátek je kovalentně navázán enzym. Druhá protilátka bývá
navázána na pevnou fázi. Po ustavení rovnováhy se vytváří "sandwich"
a následuje odstranění nenavázaného konjugátu. Po přidání substrátu je výsledný
produkt kvantifikován. Kalibrace je nelineární v celém rozsahu (nutno použít
dostatečný počet kalibračních bodů). Podle toho, kterou frakci konjugátu
použijeme k měření a o jaký substrát se jedná, je koncentrace analytu přímo
nebo nepřímo úměrná odezvovému signálu (fotometrie, luminometrie,
fluorometrie). Metoda není sice univerzálně použitelná (vyžaduje analyt se
dvěma odlišnými antigenními determinantami), ale už z teoretického principu je
citlivější a specifičtější než metody kompetitivní.
-
Homogenní enzymoimunoanalýza
Snaha o co
nejjednodušší EIA vedla k eliminaci separace volné a vázané frakce indikátoru
(konjugátu enzym-analyt).V některých případech je při tvorbě konjugátu možno
analyt vázat do těsné blízkosti aktivního centra enzymu. Po vytvoření komplexu
konjugát-protilátka, může dojít ke stérickému zastínění aktivního centra enzymu
a tím k zeslabení jeho enzymové aktivity. Výjimečně se některé enzymy chovají i
opačně (zvyšují svou enzymovou aktivitu). V každém případě po proběhlé
imunochemické reakci (vazba protilátky s analytem) je modulována (pozměněna)
enzymová aktivita konjugátu. To dovoluje vynechat separaci volné a vázané
frakce konjugátu a po ustavení rovnovážného stavu imunochemické reakce přidat
do původní reakční směsi substrát přímo a měřit odezvový signál (fotometrie,
fluorometrie). Homogenní EIA jsou velmi jednoduché z hlediska provedení, jsou
však méně citlivé. Používají se ke stanovení především nízkomolekulárních látek
(léků, drog), které se jsou v tělních tekutinách v poměrně vysokých
koncentracích.
Poznámky
Pro enzymoimunoanalýzu (EIA) se velmi často v literatuře
používá výraz ELISA (enzyme-linked imunosorbent assay). ELISA je však
speciálním druhem EIA (heterogenní nekompetitivní EIA nebo kompetitivní
heterogenní EIA). Další nepřesností je řazení některých EIA mezi FIA a LIA, i
když indikátorem je enzym vázán na protilátku nebo antigen a k detekci se
používá fluorogenní nebo lumunující substrát.
Appendixy
V imunoanalýze byly enzymy poprvé aplikovány v roce 1971
Engvalem, Perlmannem, Van Weemanem a Schuursem.
Literatura
B. Rothfeld: Nuclear Medicine in vitro. Lippicott Co.
1983
Zichová, Hušák,
Šafarčík: Vyšetřovací metody in vitro v nukleární medicíně. IPVZ Brno, 1993
Autorské poznámky
Autor: Šafarčík Kristian
Datum
aktualizace: 26. 1. 1998