Abstrakt
V počáteční fázi vývoje bylo využíváno spojení HPLC/MS s
klasickou elektronovou ionizací (EI), popř. chemickou ionizací (CI) u zařízení
s přímým vstupem eluátu nebo při spojení s nekonečným dopravním pásem. Tyto
techniky překonala technika tzv. "particle beam" spojení s EI. V
posledních letech byly navrženy speciální ionizační techniky pro spojení
hmotnostní spektrometrie s HPLC: termosprej, elektrosprej a chemická ionizace
za atmosférického tlaku. Tyto techniky se řadí mezi tzv. "měkké"
ionizační techniky umožňující určit MR neznámé látky, malé množství
fragmentových iontů znesnadňuje určení struktury, tento problém lze vyřešit
zařazením tandemu hmotnostní spektrometrie HPLC/MS/MS.
Související informace
Chromatografie-vysokoúčinná kapalinová s hmotnostní detekcí
Chromatografie-vysokoúčinná tenkovrstvá
hmotnostní detekce, KEY-Schromatografie , ionizace
Text
Text je členěn dle osnovy:
1.
Spojení
s přímým vstupem eluátu (DLI)
2.
Spojení
nekonečným pásem (MB)
3.
Particle
beam (PB)
4.
Termosprej
(TSP)
5.
Průtoková
sonda pro ionizaci FAB (CF FAB)
6.
Ionizace
za atmosférického tlaku (API)
6-a) Elektrosprej (ESP) a
iontový sprej (ISP)
6-b) Chemická ionizace za
atmosférického tlaku (APCI)
Typy spojení HPLC/MS:
1. Spojení s přímým vstupem
eluátu (DLI)
Spojení s přímým vstupem eluátu (Direct Liquid
Introduction) využívá děliče toku mobilní fáze, do hmotnostního spektrometru se
dostává jen malá část eluátu (tím dochází ke ztrátě citlivosti). Toto spojení
lze využít pouze pro kapilární kolony a kolony s malým vnitřním průměrem.
Mobilní fáze slouží jako reakční plyn pro chemickou ionizaci.
2. Spojení nekonečným pásem
(MB)
Při spojení s nekonečným pásem (Moving Belt) je eluát z
kolony rozprášen pod úhlem 45 (na nekonečný dopravní polyimidový pás. Mobilní fáze
se odpaří pod infračervenou lampou a její páry jsou odsáty vakuovými pumpami ve
dvou komorách. Analyzované látky jsou pohyblivým pásem vneseny do iontového
zdroje hmotnostního spektrometru, tam jsou rychlým ohřevem odpařeny a
ionizovány např. elektronovou ionizací. Aplikace této techniky jsou omezeny na
málo těkavé látky.
3. Particle beam (PB)
Particle beam používá proudu helia ke zmlžení mobilní
fáze vystupující z chromatografické kolony. Zmlžená mobilní fáze je dále
odpařena ve vyhřívané desolvatační komůrce. Nadbytek zplyněné mobilní fáze se
odstraní v tryskovém separátoru. Separátor je dvoustupňový. Molekuly analytu s
větší molekulovou hmotností mají vyšší kinetickou energii, takže projdou
tryskou separátoru, zatímco lehčí molekuly mobilní fáze jsou odtaženy vakuovými
pumpami. K vlastní ionizaci se obvykle využívá EI nebo CI.
4. Termosprej (TSP)
Při ionizaci termosprejem je eluát po výstupu z
chromatografické kolony veden kapilárou vyhřívanou na konstantní teplotu,
rozpouštědlo se částečně odpařuje a na výstupu z kapiláry se tvoří nadzvukový
proud směsi částečně odpařeného rozpouštědla a elektricky nabitých kapiček.
Dalším odpařováním rozpouštědla z povrchu nabitých kapiček dochází k rychlé
změně hustoty povrchového náboje až se uvolní kvazimolekulární ion z povrchu
kapičky. Vznik iontů se podporuje přídavkem iontové látky do mobilní fáze.
5. Průtoková sonda pro ionizaci
FAB (CF FAB)
Ionizace nárazem urychlených atomů (Fast Atom
Bombardment) patří mezi "měkké" ionizační techniky. Využívá se pro
analýzu polárních sloučenin a látek s vyšší molekulovou hmotností. Analyzované
látky jsou rozpuštěny ve viskózní kapalině (např. glycerol, diethanolamin) a k
ionizaci dochází nárazem urychlených atomů xenonu nebo iontů cesných (Fast ion
Bombardment). Při spojení HPLC/CF FAB (Continuous Flow FAB) je nutno přidávat
kapalnou matrici do mobilní fáze před nebo za kolonou. Předkolonový přídavek
ovlivňuje retenci analyzovaných látek, postkolonový může částečně rozmývat
separované píky. Průtoková sonda pro ionizaci CF FAB omezuje rozsah
použitelných průtoků mobilní fáze, takže pro přímé spojení s HPLC se používají
děliče toku nebo kapilární kolona. Alternativní přístup ke spojení ionizace FAB
s technikou HPLC/MS používá fritu na konci kapiláry (frit-FAB).
6. Ionizace za atmosferického
tlaku (API)
6-a) Elektrosprej (ESP) a iontový sprej (ISP)
Při ionizaci elektrosprejem prochází eluát po výstupu z
kolony kapilárou, na kterou je vloženo vysoké napětí, takže kapičky na výstupu
z kapiláry nesou elektrický náboj (podle polarity vloženého napětí). Dalším
odpařováním rozpouštědla dochází ke zmenšení kapiček, zvýšení hustoty
povrchového náboje, rozpadu na menší kapičky a nakonec se uvolní protonovaný
molekulární iont nebo adukt molekuly se sodným iontem při snímání kladných
iontů, resp. deprotonovaný molekulární iont při snímání záporných iontů.
Fragmentové ionty jsou většinou málo intenzívní. Modifikace elektrospreje -
iontový sprej používá pro zmlžení eluátu pneumatický zmlžovač na konci
kapiláry.
6-b) Chemická ionizace za atmosférického tlaku
(APCI)
Uspořádání iontového zdroje u chemické ionizace za
atmosferického tlaku (Atmospheric Pressure Chemical Ionization ) je obdobné
jako u ESP, na kapiláru však není vkládáno napětí, ale u jejího konce je
umístěna výbojová elektroda. Na konci kapiláry dochází k rozprášení eluátu
pneumatickým zmlžovačem. Vzniklý aerosol je rychle odpařen v krátké zóně
vyhřívané na vysokou teplotu. Vložením napětí na elektrodu dochází ke vzniku
výboje, kterým jsou ionizovány molekuly mobilní fáze přítomné v plynné fázi v
nadbytku vůči analytu. Ionty vzniklé z mobilní fáze (reakční plyn) následně
ionizují molekuly analytu podobně jako při klasické chemické ionizaci.
Autorské poznámky
Jaroslava Vávrová