OSN-SAbstraktOSN-E

Elektroforéza  je analytickou metodou separace ionogenních látek v roztoku (vzorku) průchodem elektrického proudu na zřetelně ohraničené zóny jednotlivých komponent nebo skupin. Při elektroforéze se jedná o mechanický přenos hmoty vyvolaný elektrickým polem.

 

OSN-SSouvisející informaceOSN-E

 

OSN-STextOSN-E

 

Následující text obsahuje tyto části:

 

A.      Pohyb nabité částice v elektrickém poli

B.      Elektrický proud a přenos hmoty

C.      Efekty uplatňující se při elektroforéze

D.      Stabilizace zón v elektroforéze

E.      Elektroforéza v plošném uspořádání

 

 

A. Pohyb nabité částice v elektrickém poli

 KEY-SElektroforézaKEY-E  patří mezi techniky obecně nazývané jako elektromigrační. Tyto techniky souvisí se schopností pohybu (migrace) nabitých částic (iontů) v elektrickém poli. Hnací silou pohybu těchto částic je rozdíl mezi elektrostatickou silou F1 a odporem prostředí F2.

 

F1 = (dU/dl) * z = E * z

 

kde:

E - intenzita elektrického pole

dU - napětí mezi elektrodami

dl  - vzdálenost elektrod

z - náboj iontu.

 

Stokesův vztah pro homogenní prostředí:

 

F2 = 6 * p * r * n * v

 

kde:

ν - viskozita

r - poloměr iontu

v - rychlost pohybu iontu

p - Ludolfovo číslo.

 

Podle Newtonova zákona je síla působící na částici o hmotnosti m úměrná zrychlení pohybující se částice a, zrychlení je dáno derivací rychlosti podle času.

 

F = m * a = m * (dv/dt)

 

 

Dosazením do předchozích vztahů lze vyjádřit hnací sílu elektromigračního děje,

 

F = F1 - F2 = m * (dv/dt) = E * z - 6 * p * r * n * v

 

Řešení pro závislost limitní rychlosti elektromigračního děje:

 

vlim = (E * z)/(6 * p * r * n)

 

kde: E - intenzita působícího elektrického pole.

 

 

1. Elektroforetická  KEY-Spohyblivost (mobilita) iontuKEY-E

Každá volná elektricky nabitá částice se v elektrickém poli pohybuje ve směru daném znaménkem svého náboje a orientací elektrického pole. Je zřejmé, že méně objemné částice s větším nábojem se budou pohybovat rychleji než částice objemné nesoucí malý elektrický náboj. Absolutní rychlost pohybu iontu v elektrickém poli o jednotkové intenzitě je dána vztahem:

 

v = µ * E = (µ * U)/l

 

kde:

v - rychlost

µ - pohyblivost iontu

E - intenzita elektrického pole

U - napětí

l - vzdálenost elektrod.

 

Vlastnosti elektrolytu zohledňuje tzv. efektivní mobilita µef.

 

 

Dráha migrace iontu                                           s = vef * t = µef * E * t

 

kde:

vef - efektivní rychlost pohybu iontu

t - čas

µef - efektivní mobilita

E - intenzita elektrického pole.

 

 

2. Vedení proudu v elektrolytu

 

Kovové vodiče se řídí Ohmovým zákonem:            i = U/R = U * G

 

kde:

i – proud

U – napětí

R - odpor prostředí

G - vodivost.

 

 

Odpor vodiče R závisí na jeho rozměrech:            R = (r * l)/S

 

kde:

r - specifický odpor (rezistivita)

l - délka vodiče (zde vzdálenost elektrod)

S - plocha.

 

Převrácená hodnota odporu se nazývá vodivost (konduktance) G:   G =(κ * S)/l

 

kde: κ - měrná vodivost (konduktivita).

 

 

B. Elektrický proud a přenos hmoty

 

1.       Přenos hmoty a elektrický proud

Elektroforetická separace je dána tím, že přenos elektrického náboje je zároveň přenosem hmoty, tj. migrací separovaných látek. Tím se liší vedení elektrického proudu v elektrolytech (pohyb iontů) od vedení elektrického proudu (pohyb elektronů).

 

2.       Kohlrauschova regulační funkce

Tato funkce byla odvozena v r.1897 Kohlrauschem pro silné elektrolyty a pro předpoklad konstantních mobilit (izotachoforéza)

 

3.       Stabilita elektroforetických rozhraní (samozaostřující efekt) (izotachoforéza)

 

 

C. Efekty uplatňující se při elektroforéze

 

1.        KEY-SJouleovo teploKEY-E  

Při průtoku elektrického proudu elektrolytem vzniká teplo. Tento ohřev je limitujícím faktorem pro používání vysokých napětí a proudů při snaze o zrychlení analýzy. Následkem vznikajícího tepla může dojít k destrukci separovaných látek, vzniku teplotních gradientů a tím nehomogenitě některých fyzikálně chemických vlastností (pH, hustota, mobilita). Snížení nežádoucího efektu Jouleova tepla spočívá v odvodu tepla ze separačního prostředí (chlazení).

 

2.        KEY-SElektroosmózaKEY-E  

Pohyb kapaliny způsobený elektroosmózou působí rušivě na ostrost zónových rozhraní - rozmývá je. K potlačování Jouleova tepla se užívají způsoby, které snižují velikost zeta potenciálu. Vhodné materiály (plasty, chemicky upravený povrch skla, struktura gelu) využívají odstranění ionizovatelných skupin. Tato úprava se provádí nejčastěji silanizací, pokrytím filmem parafinového nebo silikonového oleje, metylací volných -OH skupin atd. Používají se rovněž modifikace elektroosmoticky aktivních povrchů se surfaktanty.

 

3.       Difúze

Vzorek v elektroforetické analýze reprezentuje po nadávkování zónu analyzovaných látek, na jejichž rozhraních je velmi ostrý skok koncentrací těchto látek. S postupem času se ostrý skok koncentrací (nepůsobí-li jiná síla proti) plynule rozmývá difúzí. Výsledkem difúze jsou koncentrační profily zvonovitého (Gaussovského) tvaru.

 

 

4.       Gravitace

V horizontálním uspořádání elektroforézy se gravitace projevuje tím, že zóna, která má vyšší hustotu, se v daném prostředí rozmývá směrem ke dnu separačního kanálu (plazí se po dně), výsledkem je promíchání zóny dané látky se sousedními látkami. Při vertikálním uspořádání se hustší zóna "propadá" středem separačního prostoru.

 

 

D. Stabilizace zón v elektroforéze

 

Použití stabilizačních technik značně ovlivňuje možnosti kvalitativního i kvantitativního vyhodnocení separace a zároveň i dobu potřebnou pro analýzu.

 

a.      Hydrofilní gely

polyakrylamidový gel, agaróza

 

b.      Kapilární kolony

Kapiláry mají antikonvekční stabilizující účinky, neboť se zde již výrazně uplatňuje tzv. "wall effect". Jde o to, že u smáčené stěny kapiláry je přilnuta tenká vrstvička kapaliny, která se prakticky nepohybuje, i když další vrstvy kapaliny proudí. Má velký význam ve vysokoúčinné kapilární elektroforéze.

 

c.       Stabilizace elektrickým polem

Vhodnou volbou elektrolytového systému se navodí takové podmínky, kdy migrující rozhraní vykazuje žádoucí samozaostřující efekt. Využívá se hlavně při izoelektrické fokusaci a v izotachoforéze .

                       

                       

Využití elektromigračních dějů – analytické metody

elektroforéza

 Volná

v roztoku bez použití nosiče

 Zónová

·         na inertním nosiči (acetylcelulóza, agar, agaróza)

·         na nosiči se specifickými interakcemi (polyakrylamid, škrob)

Izoelektrické zaostřování

Izotachoforéza

Kapilární elektroforéza

 

 

E. Elektroforéza v plošném uspořádání

Separace probíhá v nosném elektrolytu, prostředí je homogenní, koncentrace pufru je výrazně vyšší než koncentrace vzorku. Uspořádání klasické elektroforetické sestavy předpokládá použití elektroforetické vany se dvěma oddělenými zásobníky separačního pufru (katodický a anodický prostor), tyto elektrolyty jsou vodivě spojeny s plochou, na které dělení probíhá. Do prostor s elektrolytem jsou vloženy elektrody (katoda, anoda), na něž je ze zdroje vkládáno stejnosměrné elektrické napětí. Odvod vznikajícího tepla bývá zajištěn obvykle chlazením spodní části desky se separačním mediem.

 

Nevýhody:

-          rozmývání zón (difúze) s časem,

-          u vysokonapěťového provedení nutnost chlazení.

 

Výhoda: současně série vzorků.

 

 

Identifikace elektroforetických  zón

Barvení vložením celé dělící plochy do detekčního roztoku, přebytek barviva z míst, kde nejsou zóny se vymyje v odbarvovací lázni.

 

Kvantitativní hodnocení - denzitometricky

-          denzitometrie v procházejícím světle,

-          denzitometrie v odraženém světle.

 

OSN-SPoznámkyOSN-E

 

OSN-SAppendixyOSN-E

 

OSN-SLiteraturaOSN-E

 

OSN-SAutorské poznámkyOSN-E

Jaroslava Vávrová