OSN-SAbstraktOSN-E

Vyysokoúčinná kapilární elektroforéza (HPCE) umožňuje využít všechny základní elektromigrační techniky - zónovou elektroforézu (CZE), isoelektrickou fokusaci (CIEF), izotachoforetické dělení (ITP), gelovou elektroforézu (CGE). Micelární elektrokinetická chromatografie (MEKC) umožňuje mimo jiné elektromigrační separaci neionogenních sloučenin. Základní instrumentace HPCE vždy obsahuje alespoň jednu separační kapiláru, zdroj napětí, dávkovač vzorku, detektor a zařízení pro záznam analytického signálu.

 

 

OSN-SSouvisející informaceOSN-E

·       Elektroforéza

·       Elektroforéza zónová

·       Elektroforéza v polyakrylamidovém gelu

·       Izotachoforéza

·       Izoelektrická fokusace

 

OSN-STextOSN-E

 

1.       Úvod

2.       Micelární elektrokinetická chromatografie (MEKC)

3.       Elektroosmotický tok (EOF)

4.       Instrumentace v HPCE

  1. Kapiláry
  2. Zdroj napětí
  3. Dávkování vzorku
  4. Detekce

5.       Aplikace HPCE v klinické chemii

A.      Předúpravy vzorků

B.      Některé oblasti aplikací HPCE, příklady

B.1. Aminokyseliny

B.2. Léky

B.3. Vitaminy

B.4. Katecholy a katecholaminy

B.5. Peptidy, proteiny, glykoproteiny

B.6. Kortikosteroidy

B.7. Organické kyseliny

B.8. Malé ionty

B.9. Nukleotidy, oligonukleotidy a nukleové kyseliny

 

 

1.       Úvod:

Vysokoúčinná kapilární elektroforéza (HPCE) - splňuje základní požadavky na moderní separační techniku:

 

2.       Micelární elektrokinetická chromatografie (MEKC)

MEKC umožňuje mimo jiné elektromigrační separaci neionogenních sloučenin. Použitím surfaktantu v elektrolytu (anionogenní např. sodium dodeczl sulfát (SDS), žlučové kyseliny, kationogenní cetyltrimethylamonium chlorid (CTAC), neionogenní Triton X-100) vznikají koloidní shluky (micely) na povrchu polární a uvnitř nepolární. Umožňuje separovat ionty s nízkou pohyblivostí.

 

3. Elektroosmotický tok (EOF)

Náboj u stěny kapiláry ovlivňuje profil snímaného signálu detekované látky. Potlačuje se u CZE, využívá se u MEKC.

 

3.       Instrumentace v HPCE

Základní instrumentace HPCE vždy obsahuje alespoň jednu separační kapiláru, zdroj napětí, dávkovač vzorku, detektor a zařízení pro záznam analytického signálu.


 


 

 

Kapiláry

Kapiláry jsou obvykle křemenné pokryté tenkou vrstvou polyimidu, výjimečně teflonové nebo skleněné s typickým vnitřním průměrem 50 - 100 µm, celková délka bývá 20 - 100 cm. Následkem působení elektrického pole v kapiláře vzniká tzv. elektroosmotický tok (EOF), který je v mnoha případech jevem nežádoucím, u micelární elektrokinetické chromatografie (MEKC) je naopak podporován, ovlivňuje se buď potažením vnitřní stěny kapiláry ochrannou vrstvou nebo vlastnostmi separačního systému tj. pH, teplotou, organickými modifikátory. Trend modifikace kapilár pro gelovou kapilární elektroforézu a isoelektrickou fokusaci směřuje k používání roztoků lineárních polymerů, kde funkčnost kapiláry lze obnovit prostým promytím roztokem příslušného polymeru.

 

A.     Zdroj napětí

HPCE využívá zdroj napětí v rozsahu 0 - 30 kV a proudu 0 - 300 mA.

 

B.      Dávkování vzorku

Objem několika nanolitrů vzorku se v HPCE dávkuje nejčastěji hydrodynamickým tokem nebo elektromigračně.

 

C.      Detekce

Je většinou zajištěna on-line snímáním signálu přímo v kapiláře:

-          UV detekce je využívána nejčastěji,

-          diode-array (DAD) je pro identifikaci elektroforetických píků při práci s biologickými matricemi velmi vhodnou metodou,

-          laserem indukovaná fluorescence (LIF) poskytuje vysokou citlivost analýzy (v ukázkových případech odpovídá detekční limit pouhým 600 molekulám),

-          hmotově spektrometrická detekce (CE-MS), ve spojení s HPCE má největší význam ionizace elektrosprayem (ESI),

-          amperometrická detekce rozlišuje oxidovatelné ionty (např. katecholaminy),

-          konduktometrická detekce využívá skutečnost, že vodivost zón analytu se liší od vodivosti pracovního elektrolytu.

 

5. Aplikace HPCE v klinické chemii

Aplikace kapilárních elektromigračních technik má nesporně mnoho výhod. Nejenom vysoká separační účinnost, selektivita, rychlá přestavitelnost systému na jiný separační režim, ale také skutečnost, že kombinací dostupných elektromigračních technik lze rozdělit téměř všechny typy sloučenin při minimální spotřebě elektrolytů a extrémně nízkých objemech vzorků, otevírá nové perspektivy v biochemii. Je řada aplikací umožňujících přímou analýzu biologického materiálu, ale na druhé straně je nutno čas to řešit specifické problémy biologických matric (např. řádové rozdíly v koncentracích stanovovaných analytů, možné interference apod.). Cesta od modelové separace standardních směsí ke stanovení analytu v biologickém materiálu musí také u HPCE projít důkladným optimalizačním postupem podmínek vlastní separace, ale i předseparačních úprav vzorku.

 

A.      Předúpravy vzorků

·       ředění (moč),

·       deproteinace např. acetonitrilem, etanolem, ultrafiltrací,

·       zakoncentrování a čištění vzorku:

            - přímo v kapiláře využitím kombinace ITP a CZE,

            - extrakčně kapalinou (rozpouštědly, pufry) nebo na pevné fázi (C18, ionexy apod.),

            - hydrolýza.

 

B.      Některé oblasti aplikací HPCE, příklady

 

B.1. Aminokyseliny - thiokarbamylderiváty nebo derivatizace fenylthiohydantoinem, dansylchloridem, či monobrombimanem, UV nebo LIF detekce, doba analýzy 13 - 30 minut.

 

B.2. Léky - monitorování včetně metabolitů, možnost rozlišení optických izomerů, určení vazebné kapacity léku na proteiny - nejčastěji MEKC s použitím SDS, UV detekce, doba analýzy 7 - 15 minut.

 

B.3. Vitaminy a jejich metabolity jako např. B-vitaminy, C-vitamin, kyseliny nikotinová a listová - CZE, UV detekce.

 

B.4. Katecholy a katecholaminy - vanilmandlová, homovanilová, a 5-hydroxyindoloctová kyselina, MEKC, UV detekce.

 

B.5. Peptidy, proteiny, glykoproteiny - mapování peptidů (CZE), analýzy sérových proteinů (SDS-CGE), separace hemoglobinů (CIEF), cytokiny, transferiny, stanovení enzymových aktivit izoenzymů LD.

 

B.6. Kortikosteroidy - MEKC s SDS v přítomnosti močoviny, UV detekce, 20 minut.

 

B.7. Organické kyseliny - citrát, oxalát, laktát, acetát, butyrát (ftalátový pufr, UV detekce, doba analýzy 5 minut, nebo možnost konduktometrické detekce při separačním systému morfolinetansulfonové kyseliny a histidinu).

 

B.8. Malé ionty - chloridy, bromidy, rodanidy, fluoridy - MEKC

 

B.9. Nukleotidy, oligonukleotidy a nukleové kyseliny (např. sekvence bází v molekule DNA, oligothymidylové kyseliny, ribonukleosidy, cyklické nukleotidy, analýza PCR produktů, CGE, MEKC, LIF nebo UV detekce).

 

OSN-SPoznámkyOSN-E

 

OSN-SAppendixyOSN-E

 

OSN-SLiteraturaOSN-E

 

OSN-SAutorské poznámkyOSN-E

Jaroslava Vávrová