Abstrakt
Vysokoúčinná kapalinová chromatografie dosahuje vysoké účinnosti a rychlosti dělení látek použitím kolon plněných velmi jemnými sorbenty, při použití vysokotlakých čerpadel mobilních fází lze pracovat s velkými průtoky mobilních fází, průtokové detektory umožňují citlivou kontinuální detekci.
Související informace
Text
Text je zpracován v odstavcích, které se zabývají těmito hesly:
1. Zásobník mobilních fází
2. Čerpadla
3. Dávkovací zařízení
4. Kolona
5. Detektory
6. Chromatografie iontových párů
1. Zásobník mobilních fází
Mobilní fáze (zpravidla směsi organických rozpouštědel nebo vodné roztoky pufrů) se před použitím filtrují (odstranění nečistot) a odplyňují (např. s použitím ultrazvukové lázně). Do systému HPLC jsou čerpány nejčastěji ze skleněných lahví. Do lahve zasahuje čerpací hadička opatřená často skleněnou fritou, zároveň mobilní fází z důvodu dokonalého a soustavného odplyňování trvale probublává hélium (jinou alternativou odplyňování je použití membránového degasseru). Zásobník mobilních fází má maximálně čtyři pozice pro současné čerpání a směšování mobilních fází.
2. Čerpadla (pumpy)
Moderní instrumentace umožňuje pracovat s tlaky až 60 MPa. Důležitá je vysoká přesnost a reprodukovatelnost průtoků v celé škále pracovních tlaků. Čerpadla bývají dělena na pulzní a bezpulzní, používají se pístová, membránová nebo pístově membránová, konstrukční řešení v kombinaci s automatickým ovládáním zpravidla uspokojivě řeší minimalizaci pulzů, materiálem pro výrobu čerpadel v HPLC je nejčastěji nerezová ocel, safír, titan, keramika.
V kapalinové chromatografii se využívá dvou modů čerpání mobilních fází:
a) isokratický, kdy je za stálého průtoku čerpána jedna mobilní fáze (jednosložková nebo vícesložková předem smíchaná), alternativně lze čerpat zároveň ze dvou až čtyř rezervoárů při konstantním poměru složek a konstantním průtoku,
b) gradientový mod, kdy v průběhu jedné analýzy lze programovaně měnit složení i průtok mobilní fáze. Kvalitní chromatografické zařízení synchronizuje činnost ventilů a čerpadel tak, aby gradientový profil byl reprodukovatelný.
3. Dávkovací zařízení
Přímý nástřik vzorku injekční stříkačkou přes septum nebo při zastavení toku mobilní fáze (stop-flow) přímo na vrstvu sorbentu v koloně je metodou se špatnou reprodukovatelností, tedy nevhodnou pro kvantitativní analýzu. Nástřiková zařízení se musí vyrovnat s vysokými tlaky na koloně, používají se především dávkovací vysokotlaké ventily se smyčkou. Dobře vybavená chromatografická zařízení mají k dispozici autosamplery se zásobníkem vzorků (nejlépe s temperací) a s programovatelnou derivatizací vzorku před analýzou.
4. Kolona
Kolony pro HPLC jsou z materiálu, který musí odolávat relativně vysokým pracovním tlakům a zároveň chemickému působení mobilních fází a separovaných složek. Materiálem chromatografických kolon je většinou antikorozivní ocel nebo specielně tvrzené borosilikátové sklo, lze použít i kombinaci obou materiálů. Pro analytické aplikace se převážně používají kolony plněné pórovitými náplněmi o průměru 3 - 10 µm o délce 5 - 30 cm a vnitřním průměrem 3 - 4 mm. Účinnost separace, doba analýzy a pracovní tlak se zvyšují s rostoucí délkou kolony a naopak klesají s rostoucím průměrem částic náplně. Při práci s kolonami o průměru menším než 2 mm se jedná o tzv. mikrokolonovou kapalinovou chromatografii, jejíž výhodou je hlavně snížení spotřeby mobilní fáze i vzorku a zvýšení citlivosti detekce. Materiály pro plnění kolon jsou většinou založeny na anorganické matrici (silikagel, oxid hlinitý, pórovité sklo), na níž mohou být chemicky vázány nebo zakotveny různé stacionární fáze, méně často se používá organických gelů různé struktury, které mohou být rovněž chemicky modifikovány. Charakter stacionární fáze závisí na chromatografickém systému. V HPLC se často vyskytují pojmy "normální fáze" a "obrácená fáze". U normálních fází jsou funkční skupiny stacionární fáze polární, mobilní fází bývá nepolární rozpouštědlo (pentan, hexan). Chromatografie na tzv. systémech s obrácenými fázemi (RP, reversed-phase, asi v 80 % všech aplikací HPLC) používá chemicky vázanou nepolární stacionární fázi. Nejpoužívanější je typ C18, kde jsou molekuly octadecylsilanu vázány na částicích silikagelu. Mobilní fáze v systému RP je polární.
5. Detektory
K detekci separovaných látek se zpravidla užívá obecných nebo specifických vlastností, kterými se tyto látky liší od mobilní fáze, na tomto základě se také rozlišují univerzální a selektivní detektory. V laboratorní medicíně jsou nejčastěji používány:
5-1. Fotometrické detektory (UV, VIS)
Většina organických látek absorbuje v oblasti UV záření, některé i ve viditelné oblasti světla. Detektory pracují buď s fixní vlnovou délkou (nejčastěji 254 nm), s možností výběru několika vlnových délek (filtrové), nebo jsou opatřeny monochromátorem a pracují na principu spektrofotometru v rozsahu 190 - 400 nm. Světlo zdroje prochází průtokovou celou, intenzita prošlého paprsku je měřena fotonásobičem, kontinuálně se snímá signál eluovaných složek.
5-2. Detektor diodového pole (DAD) umožňuje získat spektrální data látek v průběhu celé analýzy. Průtokovou celou prochází polychromatické světlo, transmitované záření je spektrálně rozkládáno holografickou mřížkou, takže na každou z miniaturních fotodiod umístěných na destičce o délce cca 1 cm dopadá zářivý tok o určité vlnové délce zeslabený absorpcí v průtokové cele detektoru. Použití DAD je podmíněno softwarovým zázemím, které umožňuje např. průběžné hodnocení tzv. "čistoty píků", identifikaci neznámých složek pomocí spektrální knihovny, rychlé stanovení absorpčního maxima látky, kvantifikaci píků s odlišnými spektrálními vlastnostmi v jedné analýze apod.
5-3. Fluorimetrický detektor je selektivní detektor s vysokou citlivostí. Při měření fluorescence se budící UV záření ze zdroje vede do průtokové cely, kde se absorbuje a vyzářené světelné kvantum o větší vlnové délce se měří fotonásobičem.
5-4. Elektrochemický detektor umožňuje stanovit velmi nízké koncentrace látek v eluentu v případě, že tyto látky jsou elektrochemicky aktivní (redukovatelné nebo oxidovatelné). Měří se proud protékající mezi polarizovatelnou pracovní elektrodou a pomocnou elektrodou v závislosti na vloženém napětí. Detektor pracuje buď jako polarografický se rtuťovou kapkovou elektrodou, nebo s tuhou elektrodou zhotovenou např. z grafitu. Obecně se tento detektor nehodí pro detekci gradientové eluce.
5-5. Vodivostní detektor měří elektrickou vodivost eluátu vytékajícího z kolony dvěma elektrodami (nerez, zlato, platina) umístěnými v průtokové cele. Tento detektor je vhodný pouze pro detekci iontů.
5-6. Hmotnostní detekce (LC-MS).
Snímání hmotnostního spektra během eluce látek je velmi výhodné pro strukturní analýzu a identifikaci látek ve složitých směsích. Technicky výhodné pro přímé napojení je používání mikrokolon a kapilárních kolon. Principu hmotnostní detekce a využití v kapalinové a plynové chromatografii jsou věnovány samostatné kapitoly.
Základní podmínkou použitelnosti detektoru je lineární závislost odezvy v širokém koncentračním rozmezí stanovované látky a plná automatizace záznamu. Oblast linearity je vymezena intervalem odezvy detektoru, kdy odchylka od lineárního průběhu odezvy detektoru v závislosti na koncentraci je menší než 2%. Směrnice lineární závislosti je mírou citlivosti daného detektoru. Minimální detekovatelné množství složky (mez detekce) je určeno nejmenším množstvím, které detektor prokazatelně zaznamená, přičemž odezva detektoru se při mezi detekce má rovnat alespoň dvojnásobné hodnotě hladiny šumu detekce. Šumem se míní kolísání odezvy detektoru způsobené náhodnými změnami nulové linie (malá časová konstanta, vysoká frekvence). Driftem se rozumí dlouhodobá nestabilita nulové linie při průtoku čisté mobilní fáze.
6. Chromatografie iontových párů
Při chromatografii iontových párů se využívá tvorby iontových asociátů (iontových párů) mezi dělenými látkami iontové povahy, tedy anionty kyselin nebo kationty bází a opačně nabitými ionty, obsahujícími lipofilní podíl. U iontového asociátu je celkový náboj neutralizován, proto je hydrofobnější než původní kyselina, zásada, nebo sůl a vykazuje výrazně vyšší retenci na nepolárních fázích. Jako protiionty pro tvorbu iontových párů se zásadami se používají silné kyseliny (alkansulfonové kyseliny) a jako protiionty pro tvorbu iontových párů s kyselinami slouží kvarterní amoniové soli (tetrabutylamoniumsulfát). V chromatografii iontových párů se zpravidla pracuje v systému kapalina-kapalina, kdy vodná stacionární fáze obsahující příslušný protion je zakotvena na inertním nosiči, organická nepolární fáze slouží jako eluent. Tato metoda se zpravidla používá v HPLC.
Poznámky
Appendixy
Literatura
Autorské poznámky