OSN-SAbstraktOSN-E

Chromatografie na papíře je aplikací techniky kapalinové chromatografie. Složky na chromatogramu putují v podobě skvrn, detegují se vhodnou fyzikální nebo chemickou metodou.Výhodou plošného uspořádání je možnost současné analýzy libovolného počtu standardů k potvrzení identity jednotlivých komponent.

OSN-SSouvisející informaceOSN-E

· Chromatografie

· Chromatografie kapalinová (LC)

· Chromatografie iontově-výměnná (IEC)

· Chromatorafie tenkovrstvá (TLC)

OSN-STextOSN-E

Chromatografie na papíře

Papírová chromatografie je nejstarší chromatografickou technikou užívanou v klinické chemii. O její věhlas se zasloužily především práce z oblasti analýzy aminokyselin a peptidů, které umožnily další objevy v biologii a biochemii. Technika kapalinové chromatografie v plošném uspořádání spočívá v tom, že sorbent má podobu tenké vrstvy. Při papírové chromatografii je touto vrstvou chromatografický papír. Princip papírové a tenkovrstvé chromatografie spočívá v tom, že při průchodu rozpouštědla papírem nebo vrstvou dochází k separaci látek. Na chromatografický papír či tenkou vrstvu se vyznačí ve vhodné vzdálenosti od okraje start s body pro nanesení analyzovaných vzorků, na označená místa se nanesou vzorky v kapalné formě a po odpaření rozpouštědla se chromatogram umístí do chromatografické komory, která je nasycena parami stacionární i mobilní fáze. Stacionární fáze je zakotvena v papíře (vrstvě), mobilní fáze protéká papírem či vrstvou vlivem kapilárních sil. Chromatografický papír se buď zavěsí do lodičky s rozpouštědlem a rozpouštědlo protéká papírem sestupně, nebo se papír stočený do válce či tenká vrstva sorbentu postaví na dno chromatografické komory, v níž je již předem připraveno rozpouštědlo (mobilní fáze), v tomto případě vlivem kapilárních sil vzlíná rozpouštědlo po chromatogramu vzhůru a unáší s sebou jednotlivé složky, které se dělí na základě svých rozpustností. Tento způsob se nazývá vzestupné vyvíjení. Vzestupné uspořádání je obvyklejší u tenkovrstvé KEY-SchromatografieKEY-E. Dosáhne-li čelo mobilní fáze dostatečné vzdálenosti, označí se a chromatogram se vyjme z komory. Po vysušení (vytěkání) mobilní fáze se provede detekce.

Ve většině případů je mechanismem separace v papírové chromatografii rozdělování mezi dvě fáze. Papír je nosičem stacionární fáze (voda, resp. komplex celulóza-voda), po impregnaci mohou být na papíře zakotvena i jiná rozpouštědla (např. dimethylformamid, parafinový olej), ke zvolené stacionární fázi se musí potom najít vhodná mobilní fáze (zpravidla směs rozpouštědel), která zajistí, že distribuční konstanty hledaných složek se od sebe budou lišit a dojde tedy k jejich rozdělení.

R_F: KEY-Sretardační faktorKEY-E - je poměr vzdálenosti středu skvrny od startu (nanesení vzorku) ku vzdálenosti startu a čela (úroveň, kam došla mobilní fáze).

Chromatografický papír

Chromatografický papír je čistý celulózový papír vyrobený z tzv. lintersových vláken (vyrábí se z bavlněných zbytků). Celulózový papír vykazuje silnou afinitu k vodě a je schopen sorbovat 5 - 20 % hmotnostních vody. Pro speciální účely jsou dostupné modifikované papíry - např. papíry acetylované, etherifikované k dělení lipofilních látek, papíry upravené pro iontovou výměnu (IEC) s vysokým obsahem volných karboxylových nebo bazických skupin.

Vyvíjecí komory

Pro vyvíjení papírových chromatogramů se osvědčily komory pro sestupné vyvíjení (a), v nichž se v horní části umístí žlábek s mobilní fází. Pro vzestupné vyvíjení (b, c, d) lze použít jakoukoli nádobu s dobře těsnícím víkem. Mobilní fáze se umístí na dně nádoby a vzlíná vzhůru.

Volba rozpouštědlového systému v papírové chromatografii

1. Soustavy s vodou jako stacionární zakotvenou fází. Mobilní fázi tvoří organické rozpouštědlo (nižší alkoholy) ve směsi s vodou. I když v rozdělovací chromatografii platí zásada, že mobilní a stacionární fáze mají být nemísitelné (aby nedocházelo k vymývání stacionární fáze), v tomto případě je voda tvořící stacionární fázi pevně vázána na celulózu, má charakter gelu a není vymývána z papíru mobilní fází. Tento typ soustavy je vhodný pro dělení hydrofilních polárních látek neutrální povahy (např. cukry, sulfokyseliny). Snížení obsahu vody v mobilní fázi vede ke snížení hodnoty R_F, naopak zvýšení obsahu vody, nebo použití organického rozpouštědla o vyšší polaritě umožňuje vyšší pohyblivost dělených látek a vede ke vzrůstu hodnot R_F.

2. Soustavy s polárními organickými rozpouštědly jako stacionární fází. Chromatografický papír se naimpregnuje zvolenou stacionární fází, po vytěkání rozpouštědla, v němž byla stacionární fáze rozpuštěna, se nanáší vzorky na start. Takto zakotveny bývají jako stacionární fáze formamid, dimethylformamid, ethylenglykolmonoacetát aj. Mobilní fáze musí splňovat podmínku nerozpustnosti s fází stacionární, nejčastěji se užívají směsi uhlovodíků - hexan, cyklohexan, benzen, toluen, chloroform a další. Se stoupající polaritou mobilní fáze se hodnoty R_F zvyšují.

3. Soustavy s nepolárními organickými stacionárními fázemi (jsou rovněž nazývány soustavami s obrácenou fází). Jedná se o zakotvení nepolárního rozpouštědla (parafinový olej, silikonové oleje, laurylalkohol, 1-bromnaftalen apod.). Mobilní fází bývají směsi polárních organických rozpouštědel a vody (methanol, ethanol, aceton, acetonitril, kyselina octová, formamid, dimethylformamid). Přídavek organického rozpouštědla v mobilní fázi vždy zvyšuje R_F stejně tak jako snížení koncentrace impregnačního roztoku zakotvené fáze. Pojem obrácené fáze je odvozen z toho, že pořadí separovaných složek se v tomto systému obrací, nejmenší hodnoty R_F mají ty látky, které jsou nejméně polární (hydrofobní s delšími alkylovými řetězci) a jsou tedy více rozpustné ve stacionární (nepolární, hydrofobní) fázi.

Detekce v papírové a tenkovrstvé chromatografii

V plošném uspořádání chromatografie je třeba odhalit místa na chromatogramu, kde se vyskytují rozdělené složky výchozí směsi.

1. Fyzikální způsoby KEY-SdetekceKEY-E spočívají ve využití záření - viditelného, ultrafialového nebo infračerveného dopadajícího na chromatogram. Některé látky se projevují jako fluoreskující skvrny, jiné naopak UV světlo zhášejí a projeví se jako tmavé skvrny na svítícím pozadí (tenká vrstva je v tomto případě impregnována např. fluorescenčním indikátorem).

2. Chemické způsoby detekce spočívají v tom, že se chromatogram postříká vhodným detekčním činidlem, které vyvolá barevnou reakci s rozdělenými látkami. Pro detekci na tenkých vrstvách se používá řady univerzálních detekčních činidel, zpravidla agresívních chemikálií (kyselina dusičná, kyselina sírová, roztok dichromanu sodného, manganistanu draselného apod.). Selektivní způsoby detekce umožňují detegovat určitou skupinu látek, např. acidobazické indikátory rozliší na chromatogramu kyseliny a báze, Ehrlichovo činidlo (2-dimethylaminobenzaldehyd) reaguje pouze s aminy, ninhydrin a izatin reaguje s aminokyselinami a některými aminy atd. Ke zvýšení citlivosti detekce a mnohdy i k umožnění detekce vůbec se často provádí derivatizace.

3. Ostatní způsoby detekce využívají různých vlastností separovaných látek - např. využití biologických vlastností látky (růst mikroorganismů).

Hodnocení chromatogramu v papírové a tenkovrstvé chromatografii

Kvalitativní hodnocení

Při potvrzování identity analyzované látky s látkou již známou se vychází ze skutečnosti, že pro každou sloučeninu je za daných podmínek charakteristická její poloha na chromatogramu (R_F) a chování při detekci (zbarvení, fluorescence apod.).

Kvantitativní hodnocení

Při kvantitativním vyhodnocování se uplatňují jak postupy přímé (in situ), tak postupy nepřímé. Nepřímý postup spočívá v extrakci látky z vrstvy a následném stanovení spektrofotometricky v UV, VIS, IČ, případně fluorimetricky, nebo nejsou-li eluované látky barevné, fotometrují se po reakci s barvotvorným činidlem. Přímé hodnocení složek na tenké vrstvě se běžně provádí denzitometrickým měřením hustoty a plochy skvrny nebo přímou fluorimetrií skvrn na desce. Pro kvantitativní hodnocení je základní podmínkou reprodukovatelné nanášení přesného objemu vzorků.

OSN-SAutorské poznámkyOSN-E

Jaroslava Vávrová