Abstrakt
V počáteční fázi vývoje bylo využíváno spojení HPLC/MS s klasickou elektronovou ionizací (EI), popř. chemickou ionizací (CI) u zařízení s přímým vstupem eluátu nebo při spojení s nekonečným dopravním pásem. Tyto techniky překonala technika tzv. "particle beam" spojení s EI. V posledních letech byly navrženy speciální ionizační techniky pro spojení hmotnostní spektrometrie s HPLC: termosprej, elektrosprej a chemická ionizace za atmosférického tlaku. Tyto techniky se řadí mezi tzv. "měkké" ionizační techniky umožňující určit MR neznámé látky, malé množství fragmentových iontů znesnadňuje určení struktury, tento problém lze vyřešit zařazením tandemu hmotnostní spektrometrie HPLC/MS/MS.
Související informace
Chromatografie-vysokoúčinná kapalinová s hmotnostní detekcí
Chromatografie-vysokoúčinná tenkovrstvá
MS tandemová
hmotnostní detekce, chromatografie, ionizace
Text
Text je členěn dle osnovy:
1. Spojení s přímým vstupem eluátu (DLI)
2. Spojení nekonečným pásem (MB)
3. Particle beam (PB)
4. Termosprej (TSI)
5. Průtoková sonda pro ionizaci FAB (CF FAB)
6. Ionizace za atmosférického tlaku (API)
6-a) Elektrosprej (ESI) a iontový sprej (ISP)
6-b) Chemická ionizace za atmosférického tlaku (APCI)
Typy spojení LC-MS:
1. Spojení s přímým vstupem eluátu (DLI)
Spojení s přímým vstupem eluátu (Direct Liquid Introduction) využívá děliče toku mobilní fáze, do hmotnostního spektrometru se dostává jen malá část eluátu (tím dochází ke ztrátě citlivosti). Toto spojení lze využít pouze pro kapilární kolony a kolony s malým vnitřním průměrem. Mobilní fáze slouží jako reakční plyn pro chemickou ionizaci.
2. Spojení nekonečným pásem (MB)
Při spojení s nekonečným pásem (Moving Belt) je eluát z kolony rozprášen pod úhlem 45 (na nekonečný dopravní polyimidový pás. Mobilní fáze se odpaří pod infračervenou lampou a její páry jsou odsáty vakuovými pumpami ve dvou komorách. Analyzované látky jsou pohyblivým pásem vneseny do iontového zdroje hmotnostního spektrometru, tam jsou rychlým ohřevem odpařeny a ionizovány např. elektronovou ionizací. Aplikace této techniky jsou omezeny na málo těkavé látky.
3. Particle beam (PB)
Particle beam používá proudu helia ke zmlžení mobilní fáze vystupující z chromatografické kolony. Zmlžená mobilní fáze je dále odpařena ve vyhřívané desolvatační komůrce. Nadbytek zplyněné mobilní fáze se odstraní v tryskovém separátoru. Separátor je dvoustupňový. Molekuly analytu s větší molekulovou hmotností mají vyšší kinetickou energii, takže projdou tryskou separátoru, zatímco lehčí molekuly mobilní fáze jsou odtaženy vakuovými pumpami. K vlastní ionizaci se obvykle využívá EI nebo CI.
4. Termosprej (TSP)
Při ionizaci termosprejem je eluát po výstupu z chromatografické kolony veden kapilárou vyhřívanou na konstantní teplotu, rozpouštědlo se částečně odpařuje a na výstupu z kapiláry se tvoří nadzvukový proud směsi částečně odpařeného rozpouštědla a elektricky nabitých kapiček. Dalším odpařováním rozpouštědla z povrchu nabitých kapiček dochází k rychlé změně hustoty povrchového náboje až se uvolní kvazimolekulární ion z povrchu kapičky. Vznik iontů se podporuje přídavkem iontové látky do mobilní fáze.
5. Průtoková sonda pro ionizaci FAB (CF FAB)
Ionizace nárazem urychlených atomů (Fast Atom Bombardment) patří mezi "měkké" ionizační techniky. Využívá se pro analýzu polárních sloučenin a látek s vyšší molekulovou hmotností. Analyzované látky jsou rozpuštěny ve viskózní kapalině (např. glycerol, diethanolamin) a k ionizaci dochází nárazem urychlených atomů xenonu nebo iontů cesných (Fast ion Bombardment). Při spojení HPLC/CF FAB (Continuous Flow FAB) je nutno přidávat kapalnou matrici do mobilní fáze před nebo za kolonou. Předkolonový přídavek ovlivňuje retenci analyzovaných látek, postkolonový může částečně rozmývat separované píky. Průtoková sonda pro ionizaci CF FAB omezuje rozsah použitelných průtoků mobilní fáze, takže pro přímé spojení s HPLC se používají děliče toku nebo kapilární kolona. Alternativní přístup ke spojení ionizace FAB s technikou HPLC/MS používá fritu na konci kapiláry (frit-FAB).
6. Ionizace za atmosferického tlaku (API)
6-a) Elektrosprej (ESP) a iontový sprej (ISP)
Při ionizaci elektrosprejem prochází eluát po výstupu z kolony kapilárou, na kterou je vloženo vysoké napětí, takže kapičky na výstupu z kapiláry nesou elektrický náboj (podle polarity vloženého napětí). Dalším odpařováním rozpouštědla dochází ke zmenšení kapiček, zvýšení hustoty povrchového náboje, rozpadu na menší kapičky a nakonec se uvolní protonovaný molekulární iont nebo adukt molekuly se sodným iontem při snímání kladných iontů, resp. deprotonovaný molekulární iont při snímání záporných iontů. Fragmentové ionty jsou většinou málo intenzívní. Modifikace elektrospreje - iontový sprej používá pro zmlžení eluátu pneumatický zmlžovač na konci kapiláry.
6-b) Chemická ionizace za atmosférického tlaku (APCI)
Uspořádání iontového zdroje u chemické ionizace za atmosferického tlaku (Atmospheric Pressure Chemical Ionization ) je obdobné jako u ESP, na kapiláru však není vkládáno napětí, ale u jejího konce je umístěna výbojová elektroda. Na konci kapiláry dochází k rozprášení eluátu pneumatickým zmlžovačem. Vzniklý aerosol je rychle odpařen v krátké zóně vyhřívané na vysokou teplotu. Vložením napětí na elektrodu dochází ke vzniku výboje, kterým jsou ionizovány molekuly mobilní fáze přítomné v plynné fázi v nadbytku vůči analytu. Ionty vzniklé z mobilní fáze (reakční plyn) následně ionizují molekuly analytu podobně jako při klasické chemické ionizaci.
Autorské poznámky
Jaroslava Vávrová