OSN-SAbstraktOSN-E

Fluorescence je druh luminiscence, u níž dochází k emisi světla v čase kratším než 10-8 s. Jedná se o emisi elektromagnetického záření při přechodu mezi dvěma stavy téže multiplicity (obvykle dvěma singlety). Molekuly absorbují světlo při jedné vlnové délce (excitační) a reemitují při větší vlnové délce (emisní).

 

OSN-SSouvisející informaceOSN-E

Luminometrie

Optické techniky

 

OSN-STextOSN-E

 

Text je členěn dle osnovy:

1.Luminiscence

2.Druhy luminiscence

2.- A. Fluorescence

2.- B. Fosforescence

2.- C. Chemiluminiscence

         Elektrochemiluminiscence

3.Fluorimetrie

3.- A. Fluorescenční polarizace

3.- B. Vztah koncentrace k intenzitě fluorescenční emise

3.- C. Omezení fluorescenčních měření

3.- C.-1 Vnitřní efekt filtru

3.- C.-2 Efekty pozadí

4.Měření fluorescence - instrumentace

 

 

1. Luminiscence

je emise světla při návratu elektronu z excitovaného stavu nebo vyšší energetické hladiny na nižší energetickou úroveň

 

2. Druhy luminiscence:

-      fluorescence

-      fosforescence

-      chemiluminiscence

 

vzájemně se liší:

         aktivací elektronu do excitovaného stavu

         způsobem vyzáření energie

 

·       kvantum světelné energie pohlcené molekulou způsobí přemístění elektronu ze základního singletového stavu do jedné z možných excitovaných posic (singletových nebo výše tripletových)

·       je-li molekula v excitovaném stavu, je několik cest návratu k původnímu energetickému stavu:
singlet excitovaný
® singlet ustálený  (fluorescence 10-8 s)
triplet excitovaný 
® singlet ustálený (fosforescence 10-4 s - 100 s)

 

2.- A.  Fluorescence

·       druh luminiscence, u níž dochází k emisi světla v čase kratším než 10-8 s

·       je emise elektromagnetického záření při přechodu mezi dvěma stavy téže multiplicity (obvykle dvěma singlety)

·       molekuly absorbují světlo při jedné vlnové délce (excitační) a reemitují při větší vlnové délce (emisní)

·       klasické fluorofory: fluorescein, rhodamin, methylumbelliferon

 

2.- B. Fosforescence

·       emise záření při přechodu mezi dvěma stavy rozdílné multiplicity (triplet - singlet)

 

2.- C. Chemiluminiscence

·       vzniká vyzářením fotonu z molekuly luminoforu po jeho chemické oxidaci

·       světlo emitované vzniká oxidační reakcí organických sloučenin (luminol, isoluminol, luciferin) působením oxidantů (H2O2 , O2 , ClO4- ) 

·       bioluminiscence: zvláštní forma chemiluminiscence - např. enzymy luciferáza, alkalická fosfatáza zvyšují efekt luminiscenční reakce

 

Elektrochemiluminiscence

·       je modifikace chemiluminiscence, kdy světlo je generováno sérií chemických reakcí iniciovaných elektrochemicky:

-      na elektrodě je dvojmocná sůl ruthenia oxidována na trojmocnou, zároveň je tripropylamin (TPA+) oxidován na radikál TPA+ , tento radikál má redukční vlastnosti, proto snadno redukuje trojmocný rutheniový komplex na dvojmocný, velký rozdíl potenciálů způsobí, že elektron z TPA přeskočí do vyšší energetické hladiny rutheniového kationtu, přechodem tohoto elektronu do základního stavu se vyzáří foton (luminiscence) a rutheniový komplex je opět schopen další oxidace

·       rutheniový kation prochází reakcí cyklicky, nespotřebovává se, chová se jako enzym

·       TPA se rozpadá na dipropylamin, je v reakci spotřebováván, slouží jako substrát

 

 

3.   Fluorimetrie

 

3.- A. Fluorescenční  polarizace

·       světlo je tvořeno elektrickými a magnetickými vlnami vzájemně kolmými

·       polarizované světelné vlny mají vektory elektrického pole orientovány v jedné rovině

·       využívá se změn fluorescenční polarizace např. v průběhu  imunologických reakcí, aplikovatelná na homogenní reakce nízkomolekulárních analytů (např. léky)

 

 

Fluorimetrie - polarizační analyzátor

·       vzorek je excitován polarizovaným světlem (získá se max. citlivost), analyzátor polarizovaného světla je nastaven k měření intenzity emitované fluorescence světla ve vertikální ploše, pak se polarizační analyzátor otočí o 90o a měří se emitované záření v horizontální rovině

 

 

                   

3.- B. Vztah koncentrace k intenzitě fluorescenční emise

·       intenzita fluorescence je úměrná koncentraci fluoroforu a excitační intenzitě

·       vztah platí pro zředěné roztoky, kde je absorbance  < 2 % excitovaného  záření

·       při absorbanci > 2 % je závislost  nelineární, je způsobena tzv. “vnitřním filtrovým efektem”

·       další faktory ovlivňující měření intenzity fluorescence:

                        a) citlivost detektoru

                        b) stupeň rozptylu světla před detekcí (ztráty, pozadí)

 

 

3.- C. Omezení fluorescenčních měření

 

Fluorescenční  měření 

·                     řádově citlivější než měření absorbance  (100 - 1000´),

·                     absorbance v roztoku je určena koncentrací a dráhou světla,

·                     fluorescence je určena koncentrací, dráhou světla a intenzitou světelného zdroje

 

Omezení fluorescenčních měření:

·       koncentrační efekty (vnitřní filtrový efekt, koncentrační zhášení)

·       efekty pozadí  (Rayleighův rozptyl, Ramanův rozptyl)

·       vliv rozpouštědel ( interferující nespecif. fluorescence a zhášení z rozpouštědla)

·       vzorkové efekty (zhášení světla, interferující fluorescence, adsorpce)

·       teplotní efekty

·       fotodekompozice vzorku

 

3.- C.- 1. Vnitřní (skrytý) efekt filtru

 

Je-li absorbance roztoku > 2 % excitovaného světla, pak může mít fluorescence nelineární průběh, v extrémním případě může být intenzita fluorescenční emise z velmi koncentrovaných roztoků  menší než emitovaná intenzita zředěných roztoků téhož fluoroforu.

 

Vnitřní filtrový efekt - excitované světlo je absorbováno samotným fluoroforem.

Eliminace:

 

Koncentrační zhášení

Makromolekula (protilátka) značená fluoroforem - při excitaci může být fluorescenční značení prostorově uzavřeno, proto dojde ke sníženému přenosu budící energie (problém průtokové cytometrie, LIF).

 

 

3.- C.- 2.  Efekty pozadí

Světlo je absorbováno molekulami při všech vlnových délkách a emitováno bez ztráty energie
(změna vibrační energie, zachováni energetických hladin)

 

Rayleighův rozptyl - nemění se vlnová délka

·       použití dobře definovaných excitačních a emisních interferenčních filtrů

·       použití polarizátorů

 

Ramanův rozptyl - změna vlnové délky

Následkem nepružných kolizí se energie mění (př. při excitaci se energie sníží, rozptyl světla probíhá při větší vlnové délce)

·       ovlivnění optikou ( za cenu snížení citlivosti)

·       volba vlnových délek (lem, lex) mimo oblast vzniku rozptylu

 

 

4. Měření  fluorescence - instrumentace

 

Základní části fluorimetru:

·       xenonový zdroj

·       zdroj napětí

·       monochromátor excitačního záření

·       kyveta (průtoková cela) se vzorkem

·       monochromátor emitovaného záření

·       detektory

·       zesilovače

·       malá část paprsku (10%) je srovnávací (přes fotonásobič)

·       emisní optika je vždy kolmá na excitační

·       používá se pro koncentrační měření předem definovaných podmínek (fixní vlnová délka excitačního záření, fixní vlnová délka emitovaného záření)

 

Excitační zdroj (abs.spektra fluoreskujících látek - 300 - 550 nm)

·       xenonová lampa zajišťující kontinuum energie pro 250-800 nm, záblesková - 2500 pulsů/sec., 200-1100 nm

·       křemenná halogenová lampa 

·       rtuťová lampa

·       laserový zdroj

 

Monochromátory

·         interferenční filtry (většinou)

·         barevné skleněné filtry

·         mřížky (spektrofluorimetr)

·         hranoly

 

Vzorková cela

·       pravoúhlé umístění vzorku v geometrii přístroje (paprsek emitovaného záření se snímá kolmo na paprsek excitačního záření) minimalizuje vliv pozadí

·       materiál - hlavně křemen

 


 

Detektory

fotonásobiče

 

Automatizované fluoro- a spektrofluorometry        

·         imunoanalyzátory

·         fluorescenční polarizované systémy (TDx , IMx , Stratus)

·         časově rozlišující (DELFIA - imunoreagencie značeny europiem)

 

Fluorometry pro speciální aplikace   

·       hematofluorometry

·       laserem indukovaná fluorimetrie

·       průtoková cytometrie

 

OSN-SAutorské poznámkyOSN-E

Jaroslava Vávrová